药物发现是药物研究最初始的步骤,也是一个复杂的研究和探索过程。现代主动药物发现的药物筛选过程主要包括靶点的识别和确证、先导化合物的发现和优化、成药性评价等过程。因此,药物发现是集成多种技术方法进行系统研究的过程。　　 在药物发现阶段,最重要的研究内容是药物的药理作用,只有具备了一定的药理作用,才有可能成为药物；但是,由于影响药物的因素是多方面的,仅仅具备了药理作用的物质并不一定能够成为药物,化合物的作用机制、ADME/T特征以及物质的状态,都影响到一种物质的成药性。　　 本文采用活性评价技术、药物作用机制研究技术、药物ADME/T特点研究技术和药物的晶型研究技术,对匹诺塞林和尼群地平进行了成药性评价,探讨不同技术在新药发现中的应用。　　 第一章匹诺塞林抗大鼠脑缺血再灌注损伤作用的研究　　 本章在前期初步证明PNCB具有神经保护和血管内皮功能保护等多种作用的基础上,对该化合物抗全脑缺血再灌注的作用进行了评价。已有实验证明,PNCB在体外的活性作用有一定的浓度范围,PNCB的浓度过高,其作用反而有下降的趋势,推测这一现象与PNCB在不同的浓度范围内,作用的靶点和激活的信号传导通路不同有关。本研究利用大鼠全脑缺血模型(4VO),以神经保护通路为中心,通过研究不同剂量PNCB对抗大鼠脑缺血再灌注损伤的机制,探讨PNCB抗大鼠脑缺血再灌注损伤的最佳剂量。　　 结果发现:(1)大鼠全脑缺血再灌注30min后给予5mg/kg PNCB的保护作用最强,给予10mg/kg PNCB的保护作用反而下降。再灌注前给药的作用不明显。(2)PNCB的神经保护作用,涉及与CREB相关的一系列信号转导通路,以及TORC-1、CAMKⅡ、PI3K、Akt、p38MAPK、JNK等信使。这些信使的活化可能与突触型NMDA受体开放有关,不同的信使作用于脑缺血损伤及PNCB给药后的不同阶段,对不同剂量PNCB的反应性不同。(3)PNCB的神经保护作用,可能足通过抑制非突触型NMDA受体发挥的。(4)PNCB浓度过高时,神经保护的信号转导通路不同程度地被关闭,从而保护作用下降。因此,5mg/kg是PNCB抗脑缺血再灌注损伤的最佳剂量。　　 本章研究表明,在活性评价过程中结合作用机制对化合物的活性作用进行综合探讨,有助于寻找化合物的作用靶点,分析相关的信号转导通路。同时,在对化合物的活性作用进行研究时,也需要注意化合物在不同剂量范围内的表现。这将为下一步研究中候选化合物药效学、药代动力学、毒理学等实验的剂量设置提供有力的参考。　　 第二章基于海兔模型的匹诺塞林对神经功能作用的研究　　 本章建立了用美国加州海兔评价药物活性的模型,考察了PNCB对海兔神经功能的作用。　　 本研究利用海兔感觉神经元/运动神经元体外共培养模型,观察PNCB的电生理作用,结果发现:(1)PNCB对SN/L7的兴奋性突触传递具有可逆的抑制作用,这一作用与PNCB的浓度有关,PNCB浓度低于100μM时,作用强度与PNCB浓度负相关,PNCB浓度高于100μM时,作用强度与PNCB浓度正相关。(2)20μM PNCB可逆地使SN/L7对5-HT的反应性消失。(3)10μM PNCB对SN/L7的长时程突触可塑性的影响不明显。以上结果提示:PNCB可能作用于SN/L7突触部位的离子通道。　　 神经突触的易化涉及新蛋白的合成,早期表现为rRNA转录水平的升高。本研究通过标记海兔核仁蛋白FBL,考察海兔感觉神经元核仁形态与突触成熟以及可塑性过程的联系,建立了利用核仁DFC区荧光标记判断细胞rRNA转录活性的方法。根据5-HT易化神经突触,PKC抑制剂chelyrethrine、PARP-1抑制剂PJ34抑制神经突触的作用,进一步确证了核仁形态与细胞活性的联系。基于以上研究,观察PNCB对核仁形态的影响。结果发现,连续给予10μM PNCB有活化SN的趋势,而连续给予40μM PNCB则抑制SN的活性。　　 海兔衰老涉及一系列基因表达的变化,这些基因在不同神经元的表达具有选择性差异。利用实时定量PCR技术考察连续注射PNCB对海兔衰老相关基因表达的影响,发现给予PNCB使K+channel在R2的表达、GluR5在R2的表达、FBL在R2和胸膜神经节的表达减少,APP、FBL在LP11的表达增加。PNCB对不同基因的作用趋势有所不同。　　 以上研究结果提示,PNCB对经典的神经生物学研究模型海兔表现出一系列药理作用。利用海兔模型研究PNCB对神经功能的作用,有助于发现PNCB活性作用的特点,为研究PNCB的内在活性及其在高等动物体内的作用机制提供参考依据。这一研究也提示,在药物发现中综合利用多种药物模型乃至模式生物,对化合物的活性特点进行综合考察,有助于提高活性化合物发现的效率。　　 第三章匹诺塞林ADME/T的特点研究　　 本节基于实验室早期对PNCB药代动力学性质的考察结果,对PNCB的代谢、排泄、毒代动力学、人血浆蛋白结合率等进行了研究。　　 PNCB首过效应明显,主要以Ⅱ相代谢产物的形式排泄。为了解释PNCB最终去向的问题,为PNCB开发成药的提供安全性的相关数据,本节利用体外肝微粒体蛋白/肝胞浆蛋白孵育体系建立了一种用于定量测定生物样品中PNCB葡萄糖醛酸结合产物和硫酸结合产物的数学方法。该方法经留一法交叉检验证实可靠。将这一模型应用于PNCB的“物料平衡”研究,发现静脉注射22.5mg/kg PNCB48h后,PNCB相关物质基本从体内排出,其中,约有40.5％的PNCB以代谢产物的形式从尿中排泄。　　 在对连续给予比格犬PNCB的毒理学进行研究时,同时考察相伴毒代动力学。结果表明:在5 mg/kg、20 mg/kg、80 mg/kg三个剂量下,连续29天给予PNCB,能够增加原型药物在动物体内的暴露水平,其中低剂量组增加更显著。80 mg/kg组在各组织中有一定蓄积,其中肝、肾残留的PNCB最多。以上结果提示:在临床试验中应注意药物可能对肝脏和肾脏产生的毒性,以及可能出现的蓄积毒性。　　 人血浆蛋白结合率的测定为药物在机体内的处置、药物作用的发挥及可能出现的药物相互作用提供参考信息。本研究利用微量平衡透析法,测得PNCB与人血浆蛋白结合率约为96.9％。　　 本章研究结果表明,在药物发现过程中对化合物的ADME/T的特点进行考察,有助于明确化合物在机体内的处置过程及终点,了解化合物潜在的毒性及可能存在的药物相互作用,尽可能地在药物发现的早期阶段排除ADME/T性质不佳的化合物,集中力量研究ADME/T性质良好的化合物,从而节约研发成本、提高研发效率。　　 第四章药物晶型评价技术在新尼群地平研究中的应用　　 本研究以NTD-Ⅰ为对照品,利用大鼠对NTD-Ⅳ原料药的物理性质和生物学性质进行多方面的评价。粉末X-射线衍射和扫描电子显微镜的结果表明,NTD-Ⅳ是一种与NTD-Ⅰ晶型形态不同的新晶型NTD,NTD-Ⅳ在0.3％SDS溶液中的溶解速度、通过Caco-2单层细胞模型的转运速度均高于NTD-Ⅰ。给予大鼠18mg/kg、90mg/kg、180mg/kg的NTD-Ⅳ,其在大鼠胃肠道的吸收速度和程度均高于相同剂量的晶Ⅰ型。在18mg/kg的给药剂量下,NTD-Ⅳ降低大鼠舒张压和收缩压的能力均强于晶Ⅰ型。　　 以市售尼群地平片为对照品,利用比格犬对以NTD-Ⅳ为主要原料的新尼群地平片的相对生物利用度进行评价。结果发现在9mg/kg NTD的给药剂量下,新尼群地平片在比格犬胃肠道的吸收优于市售尼群地平片。　　 以上结果提示:从改善吸收、稳定药效等方面考虑,NTD-Ⅳ是一种优于NTD-Ⅰ的新优势晶型,而新尼群地平片相对市售尼群地平片,是一种生物利用度更高的制剂。　　 本章研究表明,在药物发现过程中应用晶型技术,有助于改善化合物的物质形态,在提高化合物稳定性的同时,改善其溶解和吸收性质,保证药效的稳定发挥。而在晶型药物的评价中,综合应用物理学、药代动力学、生物学等方法,有助于了解晶型药物的自身特点及作用特点,提高发现优势药物晶型的效率,并为进一步的药物开发提供参考依据。　　 综上所述,本研究用活性评价、代谢分析等技术对通过静脉注射给药的化合物PNCB进行了有效性、安全性、药代动力学性质等多方面的考察；用晶型研究的多种技术对固体给药的尼群地平的物质形态及相关的物理学、生物学性质进行了研究。结果表明,在药物发现的过程中集成应用活性评价、代谢分析及晶型研究等多种技术,有助于从多方面了解化合物的性质及作用特点,有效提高化合物成药性评价的效率,也能指导下游药物开发,节约药物开发的成本。