【摘 要】
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由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨细菌溃疡病是近年来发生在我国欧美杨上的一种主要枝干病害,给欧美杨人工林健康持续发展带来严重威胁。Harpin蛋白是由革兰氏阴性菌Ⅲ型分泌系统分泌的一类具有激发子功能的蛋白质,通过激发植物的多条信号通路,诱导植株产生防卫反应,提高植株的抗病性和抗逆能力,促进植株的生长发育,具有广阔的应用前景。本研究旨在通过诱导表达harpi
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由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨细菌溃疡病是近年来发生在我国欧美杨上的一种主要枝干病害,给欧美杨人工林健康持续发展带来严重威胁。Harpin蛋白是由革兰氏阴性菌Ⅲ型分泌系统分泌的一类具有激发子功能的蛋白质,通过激发植物的多条信号通路,诱导植株产生防卫反应,提高植株的抗病性和抗逆能力,促进植株的生长发育,具有广阔的应用前景。本研究旨在通过诱导表达harpin蛋白,比较不同种类harpin蛋白对欧美杨细菌性溃疡病的防治效果,从中筛选出具有优良防效的harpin蛋白,为免疫蛋白的应用提供理论基础。主要研究结果如下:1、Harpin编码基因的获得及理化性质分析:根据基因序列设计特异性引物,从强致病力菌株N-5-1和弱毒菌株15572扩增出Hrp W、Hrp W2、Hrp N、Hrp N2 4个目的基因,经生物信息学分析,4个基因编码的harpin蛋白均富含甘氨酸与丝氨酸,不含半胱氨酸,为稳定、亲水性蛋白。对harpin蛋白的信号肽和跨膜区结构进行分析,结果显示4个蛋白均不存在信号肽以及跨膜区域。2、Harpin诱导蛋白的获得:成功构建4个基因的原核表达载体p ET-Hrp W、p ET-Hrp W2、p ET-Hrp N、p ET-Hrp N2。热激转化BL21化学感受态细胞后,IPTG诱导重组菌株表达,得到重组蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blot检测,在46.8k Da、46.8k Da、33.3k Da、33.3k Da处出现条带,所获得的重组蛋白大小与预测蛋白大小一致。将诱导表达的重组harpin蛋白接种烟草叶片进行蛋白活性检测,结果显示4种蛋白均能诱导烟草产生过敏反应,但过敏反应程度不同,由Hrp W处理组引起的过敏反应最明显。3、展着剂筛选:选用橙皮精油,高性能展着剂,Silwet L-77有机硅表面活性剂三种展着剂,从扩散面积、相对扩散面积以及干燥时间三个指标对展着效果进行对比,结果显示Silwet L-77有机硅表面活性剂的效果最好,平均扩散面积为对照组的5.5倍,平均干燥时间缩短16min。4、Harpin蛋白的防效比较:将4个目的蛋白的水溶液与展着剂混合,喷施于107杨枝干及叶片表面。观察植株变化并对蛋白进行安全性评价,结果与对照组相比无显著差异,均不会引起植株发病。然后通过刺伤方式接种病原菌,从菌含量、病斑面积以及相对防效三个方面对4种蛋白的喷施效果进行比较。菌含量测定结果显示:4个处理组较对照组菌含量均显著下降,其中Hp W处理组的菌含量最低,为2.33×10~8CFU/cm~2;Hrp N处理组的菌含量最高,为5.05×10~8CFU/cm~2。病斑面积测定,结果显示Hrp N处理组的平均病斑面积最大,Hrp W处理组的平均病斑面积最小,该结果与菌含量测定结果一致,表明喷施Hrp W后植株能有效抑制病原菌的侵染。统计枝条病情指数和并计算相对防效,最终筛选出Hrp W和Hrp N2两种蛋白激发子类免疫诱抗剂,配合展着剂喷施后其相对防效可达到41.2%和36.2%,能够显著提高107杨对欧美杨细菌性溃疡病的抗性。
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