随着分子肿瘤学的发展，人们在分子水平上对肿瘤的认识日益深入，关于肿瘤分子靶点治疗的研究与应用是当前肿瘤治疗中一个发展最为迅速的领域。化疗是肿瘤治疗的三大手段之一，但肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药性是导致化疗失败的主要原因。另外，化疗的作用机理是依耐肿瘤细胞与正常细胞在生长、修复、死亡的动力学差异，因此此类药物不可避免地会影响正常细胞，而带来临床上多种不良反应而限制其应用。分子靶点治疗是治疗介质在特异性识别肿瘤细胞或肿瘤基质靶点的基础上抑制、杀伤靶点细胞，如非结合型单克隆抗体、小分子靶点药物和基因治疗等。分子靶点治疗药物因其具有高选择性和低毒性，已成为肿瘤治疗的又一有力手段。 细胞内和细胞间的信号转导是生物体各种生物学行为的基础，信号通路的异常与肿瘤的关系十分密切。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor)属于酪氨酸激酶受体超家族erbB成员之一。许多肿瘤中表皮生长因子表达增强，包括结肠、头颈鳞状上皮细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌等。EGFR的表达或功能的改变增强配体产生，增加受体基因转录或扩增，或受体突变导致其酪氨酸激酶持续激活，从而致使其下游信号通路的增强，最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进生存，在多种肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用。因此，近年来以EGFR为靶点的药物的开发和应用已成为研究热点，并在临床应用中取得巨大的突破。 顺铂是一个应用于临床有三十多年历史的经典化疗药物，被广泛地应用于多种肿瘤的治疗，如卵巢癌，大肠癌，非小细胞肺癌等。但其常易引发耐药而致预后较差，同时顺铂的毒性反应所导致的低耐受性也限制了其临床应用。因此，寻找低毒安全的化疗增敏药物联用是提高顺铂临床应用效果的一个重要方向。西妥昔单抗(Cetuximab，IMC-C225)是第一个在全球多个国家获准上市的特异性靶向EGFR胞外区的人鼠嵌合型单克隆抗体，已在多种肿瘤的体外和临床实验中取得了良好的抑瘤效果，在大肠癌、头颈肿瘤、非小细胞肺癌等肿瘤的治疗中其与化疗药物联用显著地提高的化疗疗效，而且不良反应轻，不增加化疗药物的毒副反应，耐受性较好。目前已被美国FDA批准用于晚期的结直肠癌和化疗失败的复发性和转移性头颈肿瘤以及其它恶性肿瘤的辅助治疗。但是西妥昔单抗在临床中的应用仍存在盲目性和无选择性，目前也仍然缺乏确实有效的可预测疗效的分子标志物来指导其应用。本课题通过研究昔妥西单抗对于鼻咽癌及肺癌细胞株体外和体内的顺铂敏感性的影响来探讨其是否具有增敏顺铂疗效、是否可以逆转对顺铂的耐药，以及可能的机制，为西妥昔单抗在临床中的选择性应用提供参考和理论依据。 一、西妥昔单抗与顺铂联合对肿瘤细胞增殖的影响 1.西妥昔单抗单药对肿瘤细胞增殖的影响我们首先观察了西妥昔单抗单药对四株鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、SUNE1和HONE1及一对肺癌细胞A549和A549／DDP生长的影响，分别以2.5、5、10、20、40、80、160 μ/ml的西妥昔单抗处理细胞72h后，MTT法检测其抑制效果，在四株鼻咽癌细胞和肺癌细胞中其抑制率一直低于20％，表明西妥昔单抗单药对鼻咽癌和肺癌细胞的生长无明显的抑制作用，且无剂量依耐性。 2.西妥昔单抗联合顺铂对肿瘤细胞增殖的影响以低于细胞毒作用浓度的顺铂(0.16 μg／ml)与浓度分别为2.5、5、10、20、40、80、160 μg/ml的西妥昔单抗联合应用，能显著抑制鼻咽癌细胞增殖并呈剂量依赖性，但在西妥昔单抗浓度达20-40 μg／ml时对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用达到平台。在肺癌A549细胞中我们也观察到了同样的作用趋势，但是不同浓度的药物处理对A549／DDP细胞的增殖影响不明显。 二、西妥昔单抗对肿瘤细胞的细胞周期分布的影响用100μg/ml的西妥昔单抗处理细胞24h后，经流式细胞术检测，结果显示处理组和对照组细胞周期分布无明显差别，表明西妥昔单抗单药对鼻咽癌和肺癌细胞的细胞周期分布无明显影响。但西妥昔单抗与顺铂联用可增加顺铂对细胞周期分布的作用，即增加sub-G1期和G1期的细胞，减少S期细胞的分布。 三、西妥昔单抗对EGF活化的EGFR信号通路的影响EGFR信号通路有三条主要下游信号通路，即ras-raf-MAPKs信号通路；PI3K-AKT信号通路；JAK-STAT3信号通路。ERK、AKT和STAT3分别是这三条信号通路中的关键分子，我们通过检测p-ERK、p-AKT和p-STAT3的组成性表达水平来判断这三条通路的活化水平。先用浓度为0.1、1、10、100 μg／ml的西妥昔单抗将细胞处理24小时后，再用10ng EGF刺激15分钟，经Western blot检测显示，EGF可显著地活化EGFR下游的三条信号通路，但是此活化作用可被西妥昔单抗所抑制，即p-ERK、p-AKT和p-STAT3的表达水平可被西妥昔单抗作用而较对照组减少，且此抑制作用是呈浓度依耐性的增加的，但它们的总蛋白表达水平始终无变化。这表明西妥昔单抗是可以发挥其与EGFR的配体竞争性结合EGF从而抑制下游信号通路的活化的。我们在顺铂敏感细胞株和耐药细胞株中均观察到了类似的效应。 四、西妥昔单抗对DDP活化的EGFR信号通路的影响为了研究两药联合作用的机制，我们用浓度分别为5、10、20μM的顺铂处理细胞，观察其对EGFR信号通路活化的影响。Western Blot结果显示，在顺铂敏感的细胞株，顺铂可浓度依耐性地上调EGFR信号通路的活化，使得p-ERK和p-AKT的表达上调。同样，我们先用浓度为0.1、1、10、100μg／ml的西妥昔单抗将细胞处理24小时后，再用10 μM DDP刺激后，Western blot检测p-ERK和p-AKT的表达水平显示，DDP对EGFR信号通路的活化作用可被西妥昔单抗所抑制，即DDP诱导的p-ERK、p-AKT的上调表达可被西妥昔单抗抑制，此作用是呈浓度依耐性的增加的，而它们的总蛋白表达水平始终无变化。在顺铂耐药细胞株中，顺铂并不能明显刺激活化EGFR下游信号通路，即对p-ERK和p-AKT的表达水平无调节作用，且西妥昔单抗对此也无明显影响。 五、西妥昔单抗对裸鼠体内移植瘤生长的作用为了观察西妥昔单抗在体内对肿瘤细胞生长的影响，我们分别建立了HONE1细胞和A549细胞的裸鼠体内抑制瘤模型，分为四组，分别给予不同处理：生理盐水对照组、西妥昔单抗单药组、顺铂单药组和两药联用组。HONE1细胞和A549细胞裸鼠体内实验均显示：昔妥西单抗单药组的肿瘤体积变化与生理盐水对照组相比无显著性差异；而顺铂单药组和两药联用组肿瘤体积均明显小于对照组;两药联用组的肿瘤体积增长较顺铂单药组慢，具有统计学差异。各处理组治疗前后未见药物毒副反应． 免疫组化结果显示在HONE1细胞裸鼠移植瘤标本中p-AKT及p-ERK在顺铂单药处理组中较生理盐水对照组明显上调，而昔妥西单抗组和两药联用组则无明显变化；在A549裸鼠移植瘤标本中p-ERK在顺铂单药处理组中较生理盐水对照组明显上调，而昔妥西单抗组和两药联用组则无明显变化，p-AKT在各处理组均为高表达。ERCC1在顺铂单药处理组中较其他组表达略高。 六、西妥昔单抗对肺癌细胞切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达的影响 七、下调ERCC1的表达对肺癌细胞的药物敏感性的影响ERCC1的表达和调控在A549和A549／DDP细胞中存在差异。我们通过SiRNA干扰的手段来抑制ERCC1的表达，探讨去除了ERCC1调控的影响对于细胞的顺铂敏感性的有无改变。在分别瞬时转染ERCC1的SiRNA48h后，再分别用西妥昔单抗单药、顺铂单药及两药联用处理细胞，经MTT检测药物的抑制作用。结果显示：在A549/DDP细胞，ERCC1的表达被干扰后，两药联用的效果较在阴性对照组显著增强，而在转染阴性对照SiRNA的A549／DDP细胞，西妥昔单抗和顺铂联用较顺铂单药处理对细胞的生长抑制作用无明显差别；扣除ERCC1干扰本身对顺铂敏感性的增强后，两药联用组的抑制效果仍较顺铂单药组好。在A549细胞，ERCC1的表达被干扰后，两药联用的效果较在阴性对照组无显著差异，且ERCC1干扰本身对A549细胞的顺铂敏感性无明显影响。 结论 1.西妥昔单抗单药对鼻咽癌和肺癌细胞的增殖和细胞周期均无明显影响，但可显著增强顺铂对敏感株细胞的增殖的抑制作用，而对肺癌耐药株细胞的药物敏感性无明显影响。 2.顺铂可诱导鼻咽癌和肺癌顺铂敏感细胞株中EGFR信号通路的活化并上调ERCC1的表达，此活化作用可被西妥昔单抗所抑制；而耐药株细胞EGFR信号通路的活化和ERCCl的表达不受顺铂和西妥昔单抗的作用的影响。 3.用RNA干扰的方法下调ERCC1的表达后，西妥昔单抗可提高肺癌耐药细胞株对顺铂的敏感性。 4.西妥昔单抗可提高顺铂敏感细胞株对顺铂的敏感性，而对耐药细胞无此作用，其机制可能与DNA损伤修复的调控相关。