几丁质是高等真菌细胞壁的重要组分之一,几丁质酶可以通过降解真菌细胞壁中的几丁质来破坏细胞壁正常结构,从而抑制或减慢真菌的进一步侵染或扩展。作为几丁质酶家族中的重要组成部分,植物几丁质酶在参与植物抵御病原菌的侵染以及病害的生物防治中占据着重要地位。本文以川西云杉（Picea likiangensis var.balfouriana）健康一年生幼嫩针叶为试验材料,利用RT-PCR技术克隆获得川西云杉几丁质酶PlCHI基因的全长cDNA序列,生物信息学分析核苷酸和氨基酸序列信息,进一步构建过表达载体,诱导重组蛋白表达,并筛选诱导表达的最适条件,检测其可溶性。选取五种病原菌进行功能验证。利用qRT-PCR检测PlCHI基因在三种不同云杉树种感染落针病后的表达水平变化,进一步验证该基因在响应云杉落针病过程中的作用。主要研究结果如下:1.成功克隆得到川西云杉PlCHI基因的cDNA序列全长（基因登录号:MK054239）。该序列长1017 bp,包含一个完整的1017 bp的ORF,共编码338个氨基酸。序列比对结果表明,该基因序列与杂交云杉和北美云杉的序列一致性高达94%以上,表明PlCHI基因属于云杉几丁质酶基因家族的成员之一。2.生物信息学预测结果表明,PlCHI蛋白存在潜在磷酸化位点和跨膜结构域,且在序列首端存在潜在信号肽位点,属分泌蛋白,二级和三级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋2个元件组成。结构域预测发现,PlCHI蛋白为I类几丁质酶,属19家族,兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性。同源性和系统发育分析可知,PlCHI蛋白序列与其他不同种类的植物几丁质酶蛋白序列同源性较高,进化较为保守。3.构建了原核表达载体pET-32a-PlCHI,将其转入感受态细胞E.coli DH5α中并诱导其表达,蛋白电泳得到一段长约为45 k Da的蛋白,主要以包涵体的形式存在,采用0.2 mmol/L的IPTG在25℃下诱导4 h表达量最佳。4.对收集到的包涵体进行变性、复性和纯化,利用Bradford法检测纯化蛋白的浓度为90.96μg/m L,酶活性为1.56 U/m L。其最适p H为7,最适温度为40℃。将复性蛋白作用于不同病原菌菌丝发现,经72 h后,与对照组相比,处理组的云杉散斑壳、层出镰刀菌、胶孢炭疽菌的菌丝出现异常、内含物凝结,形态结构发生了明显变化。由此推测复性后的PlCHI蛋白能破坏部分真菌的正常生长结构,对其菌丝生长有一定的抑制作用。5.qRT-PCR分析可知,丽江云杉、川西云杉和粗枝云杉在感染云杉落针病后根部、针叶、嫩枝和韧皮部中PlCHI基因的表达水平均发生了显著变化,且在根部、针叶和嫩枝三个组织中均呈现上调趋势,表明在感染落针病病原菌后,云杉体内的几丁质酶对病原菌的入侵产生了响应。