研究背景:　　随着辅助生殖技术(assistedreproductiontechnology,ART)的不断发展,冷冻胚胎移植(frozen-thawedembryotransfer,F-ET)已经成为辅助生殖领域中不可或缺的组成部分,F-ET周期可有效降低多胎率,很大程度上避免了卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimulationsyndrome,OHSS)的发生和加重,同时,可以提高单次取卵累积妊娠率,减轻患者的心理和经济压力。随着冷冻胚胎技术的逐渐成熟,已由传统的慢速冷冻保存技术发展到玻璃化冷冻技术,进一步完善玻璃化冷冻技术和提高胚胎复苏率已经成为生殖领域的研究焦点。　　玻璃化冷冻胚胎实际上是个脱水的过程,而胚胎复苏则是细胞外水分子和小分子物质回复细胞内的过程。有研究表明,细胞内外的渗透压平衡取决于水分子和冷冻防护剂在细胞内外的有效跨膜转运,而细胞内外的渗透压平衡又是成功冻融和复苏胚胎的关键所在。近年来发现,除了水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)外,尚未发现其他可以介导水转运的跨膜蛋白。AQPs是一组参与水转运、能维持细胞内外渗透压稳定的跨膜蛋白,广泛分布于植物、动物和微生物的生物膜上。随着对AQPs的深入研究,迄今为止,已检测出11种AQP亚型(AQP0-10),丰富表达于哺乳动物的生殖系统,在生殖生理和病理过程中扮演着不可或缺的角色。同时在ART中,对于优化卵子和胚胎冷冻技术,提高冷冻复苏率也具有重要意义。　　本课题将从玻璃化冻融过程中可能的分子机制及相关临床数据分析两大方面进行研究,首先对2012年1月至2013年1月在本生殖中心行玻璃化冻融胚胎移植的609个周期临床资料进行回顾性研究,探讨不同质量的玻璃化冻融后胚胎对其临床结局的影响,为选择合适时期和高质量的冻融胚胎移植提供理论依据。并通过免疫荧光技术检测AQPs在人类早期胚胎上的表达亚型及分布特征,同时选取在人类早期胚胎上有高表达且可能在高渗冷冻防护剂环境中发挥作用的AQP3,对比玻璃化冻融前后胚胎上AQP3的表达变化,以探讨AQP3在胚胎冻融过程中可能发挥的调节作用机制。　　研究内容:　　第一部分:玻璃化冻融后胚胎的质量对其临床结局的影响　　研究目的:　　探讨不同质量的玻璃化冻融后胚胎移植对其临床结局的影响,为选择合适时期和高质量的冻融胚胎移植提供理论依据。　　研究方法:　　收集2012年1月至2013年1月期间广东省妇幼保健院生殖中心609个行玻璃化冷冻胚胎周期且均为移植2枚冻融后胚胎的临床资料。根据冻融后裂解期胚胎的卵裂球数目、胚胎的发育时期及胚胎的完整性的不同分别进行分组,分析三者对临床结局的影响。研究结果采取SPSS18.0的统计学分析软件,年龄、内膜厚度组间比较采取T检验,组间率之间的比较均采取行×列列表资料的χ2检验,P<0.05表示差异有显著性。　　研究结果:　　(1)移植卵裂期不同卵裂球数目的冻融后胚胎对临床结局的影响　　根据玻璃化冻融复苏后卵裂期胚胎的卵裂球数目分为三组:A组:细胞数为4-7的胚胎组;B组:细胞数为8的胚胎组;C组:细胞数为9-14的胚胎组。结果如下:三组的年龄和移植当日内膜厚度的两两比较均无统计学意义(P>0.05);A组的胚胎种植率、临床妊娠率显著低于B组和C组,差异具有统计学意义(P<0.05);C组的胚胎种植率、多胎率、流产率和临床妊娠率均高于B组,差异均无统计学意义(P>0.05)。　　(2)移植不同时期的冻融后胚胎对临床结局的影响　　根据玻璃化冻融复苏后继续培养后移植不同时期的胚胎分为三组,A1组:卵裂期胚胎组(细胞数8-14个);B1组:桑椹胚组;C1组:囊胚组,每组胚胎都由卵裂期胚胎冷冻-解冻继续培育而成。结果显示:三组的年龄和移植当日内膜厚度的两两比较均无统计学意义(P>0.05);A1组的胚胎种植率、临床妊娠率及多胎率均低于其余两组,其中种植率和多胎率的比较具有统计学意义(P<0.05),临床妊娠率的比较无统计学意义(P>0.05);C1组的临床妊娠率和多胎率高于B1组,种植率低于B1组,差异均无统计学意义(P>0.05);三组流产率的比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。　　(3)移植冻融后胚胎的完整性对临床结局的影响　　根据玻璃化冻融后胚胎是否完整分为两组:A2组:完整胚胎组;B2组:非完整胚胎组。结果显示:两组的年龄和移植当日内膜厚度的比较均无统计学意义(P>0.05);A2组的胚胎种植率和临床妊娠率显著高于B2组,差异具有统计学意义(P<0.05);A2组的多胎率和流产率高于B2组,差异无统计学意义(P>0.05)。　　研究结论:　　1.临床上选取移植玻璃化冻融复苏后卵裂期胚胎尽可能包含1枚8-14细胞的胚胎。　　2.移植复苏后不同时期的胚胎应根据患者子宫内膜环境和胚胎的发育情况共同决定。　　3.玻璃化冻融后非完整胚胎的发育潜能低下,对其临床结局有较大的影响。　　第二部分:水通道蛋白在人类早期胚胎上的表达　　研究目的:　　明确AQP1、AQP3、AQP7、AQP8四种AQP亚型在人类早期胚胎上的表达情况,探讨AQPs在人类早期胚胎发育过程中的可能机制。　　研究方法:　　收集2012年1月至2013年1月在广东省妇幼保健院生殖中心体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)和单精子卵母细胞胞浆内注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)术后第3天(D3)废弃2PN胚胎(细胞数≤4个,细胞碎片<50％)、异常受精1PN和3PN胚胎(细胞数≥6个,细胞碎片<50%)及第6天(D6)由废弃胚胎孵育出的囊胚作为研究对象。采取免疫荧光检测技术对人类早期胚胎分别进行AQP1、AQP3、AQP7、AQP8表达的定性检测。　　研究结果:　　在人类胚胎各个发育时期均可见AQP3绿色荧光信号,在卵裂期主要定位于卵裂球的胞核,胞质和胞膜可见荧光信号,在囊胚期绿色荧光信号定位于囊胚腔和内细胞团、滋养细胞层胞核、胞质、胞膜处;在卵裂期1PN和3PN胚胎及囊胚阶段均见AQP7荧光信号,均质分布于卵裂球的胞核、胞质和胞膜处,而在囊胚上主要定位于内细胞团的胞核处;AQP8绿色荧光信号仅见于囊胚,定位于内细胞团和滋养细胞的胞核、胞质及胞膜上;AQP1在胚胎各个阶段均未见绿色荧光的表达。　　研究结论:　　1.AQP3、AQP7、AQP8在人类早期胚胎中有阳性表达,且与其在小鼠胚胎上的分布有一定区别,提示AQPs与人类早期胚胎潜能存在密切关系;　　2.不同的AQP亚型表达的时期和部位可随各个发育时期发育的需要相应调节,提示AQPs对人类早期胚胎的发育起着积极的调控作用。　　第三部分:水通道蛋白3在人类早期胚胎玻璃化冻融前后的分布和表达变化情况　　研究目的:　　比较AQP3在人类早期卵裂期和囊胚期胚胎玻璃化冻融前后的分布特征及表达变化情况,以探讨AQP3在人类胚胎冻融前后可能发挥的作用及调节机制。　　研究方法:　　收集2012年1月至2013年1月在广东省妇幼保健院生殖中心行IVF-ET和ICSI术后D3异常受精1PN和3PN胚胎(细胞数≥6个,细胞碎片<50%)及D6由废弃胚胎孵育出的囊胚作为研究对象。对这两组胚胎分别进行玻璃化冷冻-解冻复苏。采取免疫荧光检测技术对玻璃化冻融-解冻复苏后胚胎和收集的同期新鲜胚胎进行AQP3表达的定性检测。应用蛋白印迹(westernblot)技术对新鲜胚胎和同期玻璃化冻融复苏后胚胎上AQP3蛋白表达量的检测。实验重复3次,westernblot以GAPDH条带作为内参对样本蛋白量进行校正,结果利用ImagePlus6.0图像软件进行分析,均取平均值进行计算,采取SPSS18.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。　　研究结果:　　(1)免疫荧光检测　　在新鲜卵裂期胚胎上,AQP3绿色荧光信号主要分布在卵裂球的胞核,胞质胞膜次之;新鲜囊胚期绿色荧光主要集中在囊胚腔和内细胞团、滋养细胞层胞核、胞质、胞膜处。冷冻复苏后,卵裂期胚胎绿色荧光信号均质的分布于卵裂球的胞核、胞质及胞膜;囊胚期绿色荧光集中于内细胞团胞核及滋养细胞层胞核,胞质及胞膜可见绿色荧光。　　(2)westernblot　　新鲜囊胚期胚胎AQP3蛋白表达量高于新鲜卵裂期胚胎,组间差异有统计学意义(P<0.05);冷冻复苏后,检测到囊胚期AQP3蛋白含量也高于卵裂期,组间差异有统计学意义(P<0.05);在卵裂期和囊胚期,冻融复苏后胚胎AQP3蛋白表达量均低于新鲜胚胎,且差异均有统计学意义(P<0.05)。　　研究结论:　　1.AQP3参与人早期胚胎玻璃化冻融过程,且在冻融前后卵裂期和囊胚期胚胎表达部位不同,发挥的作用和方式可能完全不同;　　2.在卵裂期和囊胚期胚胎冻融后AQP3表达量均下调,推测在这两个时期还有其他AQP亚型参与或者主导玻璃化冻融过程中水分子和冷冻保护剂的跨膜转运。