随着基因组学和临床医学的发展,人类对一些疾病的细胞生物分子相互作用网络和关键生理途径的了解日益加深。在疾病发展过程中,人体体液中某些生物分子的含量会发生异常变化,将这类生物分子统称为生物标志物,其可用于指示疾病的进程和评估疾病的严重程度。因此,检测痕量生物标志物,包括核酸、小分子和蛋白质等,对理解其生物学和生理功能以及开展疾病临床诊断和治疗至关重要。生物传感器是集生物识别系统和信号处理系统为一体的分析检测平台,具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优势,其在疾病的早期诊断、药效评估和监测治疗中的应用受到了研究者们的广泛关注和探索。由于人体体液极其复杂多变,疾病发展初期,在血液中寻找靶标生物标志物犹如大海捞针。因此必须不断提高生物传感器的分析性能。电化学生物传感器是多学科交叉融合的产物,其开发涉及到化学、生物学、微电子学、医学、材料学等多个学科。相比于其它依赖大型仪器的生物传感器,电化学生物传感器展现独特的优势。其具备电化学分析技术的高灵敏度、快速响应、仪器便携性和构造成本低的优点,以及生物识别固有的高特异性,同时还具有易于微型化、多路复用的能力。目前,电化学生物传感器已成为了一种具有重要价值的分析检测工具。随着对现场传感和即时检测需求的不断增加,对电化学生物传感系统在灵敏度、特异性、时效性及制备方法等方面提出了更高的要求。将新方法和新技术与等温核酸扩增策略、功能型材料、微电极技术相结合,有望满足电化学生物传感平台的检测标准。本论文旨在结合电化学分析技术开发新的生物传感器,重点在于提高传感器的检测灵敏度和简化传感器的制备。主要通过设计新型等温核酸扩增策略,结合功能型材料和光电化学分析技术构建具有高灵敏度的电化学生物传感器;借助核酸、酶和适配体作为生物识别元件以及设计双识别结合策略提高传感器的特异性;并通过设计免固定化传感模式简化电化学生物传感器的制备步骤。本论文构建了几种性能优异的电化学生物传感器,用于特异性地、灵敏地检测与疾病相关的小分子、核酸和蛋白质。并对其检测原理、可行性及分析性能等方面进行了深入的探讨。本论文的主要研究内容总结如下:1.基于PTB7-Th/PAni Hs的光电化学酶生物传感器研究借助三维聚苯胺水凝胶（PAni Hs）来增强供体-受体型光电活性材料（PTB7-Th）的电子转移速率和光电转换效率。并结合黄嘌呤氧化酶-鸟嘌呤生物催化反应和氧气敏感型光电活性材料之间竞争消耗氧气机制,开发了一种光电化学酶生物传感器用于检测鸟嘌呤。三维PAni Hs具有优异的导电性、分层多孔的仿生结构以及对溶剂分子的高渗透性,不仅可以直接作为PTB7-Th和黄嘌呤氧化酶的载体,提高分子的固载量,而且其独特的结构促进了水溶性物质和电子的扩散,极大地增强了初始光电流信号。在鸟嘌呤存在的情况下,黄嘌呤氧化酶会催化其氧化为尿酸,随着电解质溶液中溶解氧的消耗,初始光电流逐渐降低。降低的光电流与鸟嘌呤的浓度有关,因此实现对鸟嘌呤的检测。通过扫描电子显微镜、能谱仪和X射线光电子能谱分析了PAni Hs和PTB7-Th/Pani Hs的形貌、元素种类和化学键。通过傅立叶变换红外光谱法测试证实了PAni Hs与黄嘌呤氧化酶之间的Schiff碱反应。采用紫外-可见漫反射光谱研究了PAni Hs、PTB7-Th和PTB7-Th/PAni Hs的光吸收特性,并根据Tauc方程计算了PTB7-Th和PTB7-Th/PAni Hs的禁带宽度。进一步探讨了光电活性材料的电子转移机理。随后对传感器检测鸟嘌呤的可行性和分析性能进行了研究。开发的光电化学酶生物传感器可实现鸟嘌呤的高灵敏检测,检出限为0.02μmol/L。通过苯胺单体、植酸和聚合引发剂的快速聚合反应,在3分钟内将PAni Hs组装到玻璃碳电极表面上,大大简化了电极制备过程。特别是,所提出的光电化学酶生物传感器不仅可拓展到其它需氧型酶生物分析,而且为绿色环保型导电水凝胶材料在光电化学生物分析中的应用奠定了基础。2.滚环扩增-CRISPR/Cas12a介导的通用免固载型电化学生物传感平台研究设计滚环扩增-规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a核酸扩增,并结合亲和力介导的免固定化策略,构建了一种免固载型电化学生物传感器用于疾病相关的核酸靶标和非核酸靶标的检测。在该策略中,利用模块化的滚环扩增实现靶标识别事件的转化。通过滚环扩增反应,靶标识别事件转化为触发DNA链（TS）,随后TS激活Cas12a酶的脱氧核糖核酸酶活性进一步放大信号。靶标诱导阻断探针（BP）裂解促使亚甲蓝分子标记的报告探针（RP）被还原氧化石墨烯修饰的电极捕获,从而导致电化学信号明显增加。该策略只需要简单调整参与滚环扩增反应组分的靶标识别序列,即可实现对micro RNA-21、细小病毒B19DNA和三磷酸腺苷的灵敏和特异性检测,检出限分别为0.83 amol/L、0.52 amol/L和0.46 pmol/L。该电化学传感平台具有较好的选择性和抗干扰能力,能用于复杂血清中的靶标分析。此外,构建了DNA输入的四种DNA逻辑电路（包括YES、NOT、OR和AND）,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明了所设计的滚环扩增-CRISPR/Cas12a核酸扩增策略的模块化设计和可编程性。而且所提出的电化学生物传感器不需要复杂、耗时的表面探针固定化步骤,且展现出“信号增强型”检测模式。由于滚环扩增-CRISPR/Cas12a核酸扩增策略具有极强的可编程性和集成性,该电化学传感平台具有优异的通用性（普适性）,克服了现有的免固载型电化学生物传感器只适用于一种靶标检测的局限性,有望用于临床诊断中各类疾病标志物的早期检测。3.基于BIDSD-RCA-CRISPR/Cas12a的免固载型电化学适体传感器研究利用结合诱导DNA链置换策略将凝血酶–适配体相互作用转化为核酸链输出,进而触发滚环扩增反应调控Cas12a酶的脱氧核糖核酸酶活性。基于石墨烯对ss DNA和ds DNA的亲和力差异,构建免固载型电化学适体传感器实现对凝血酶的灵敏检测。具体来说,分裂的两段适配体同时结合凝血酶的不同位点触发DNA链置换反应。随后,释放出的核酸链引发滚环扩增反应,生成大量含有触发DNA链（TS）序列的长链DNA扩增子。TS链激活Cas12a酶剪切阻断探针（BP）,因此标记有亚甲蓝分子的报告探针（MRP）能够稳定地吸附在还原氧化石墨烯修饰的电极表面,产生明显增强的电化学信号。通过结合滚环扩增-CRISPR/Cas12a生物信号放大策略,该电化学适体传感器实现了对凝血酶的灵敏检测,计算出的检出限为12 fmol/L。得益于适配体对凝血酶的高特异性及双位点识别方式的高亲和力,使该电化学适体传感器具有较好的选择性和抗干扰能力,能用于复杂血清中的凝血酶分析。此外,该电化学适体传感器不需要复杂、耗时的探针固定化步骤。该工作的开展为疾病早期诊断中低浓度蛋白生物标志物的检测提供了一个范例。4.基于Y型探针介导的无引物循环信号扩增的微电极传感平台研究设计Y型探针介导的无引物循环信号扩增策略,并自制碳纤维电极,开发了免固载型电化学传感平台用于DNA甲基转移酶活性检测及其抑制剂筛选。基本思路是通过Y型探针介导的无引物循环信号扩增策略将DNA甲基转移酶剪切行为转化为大量富鸟嘌呤（G）DNA链输出。在钾离子存在时,富G DNA链折叠成G四链体结构捕获溶液中的亚甲蓝分子,引起溶液中的亚甲蓝的扩散电流降低,从而实现灵敏检测DNA甲基转移酶活性。结合独特的信号转导方式和Y型探针介导的无引物循环信号扩增策略,该免固载电化学生物传感器对DNA甲基转移酶活性具有高选择性和灵敏度,计算出的检出限为2.5×10-4 U/m L。此外以庆大霉素作为抑制剂,评估了该传感器在筛选DNA甲基转移酶抑制剂方面的能力。并且该传感器成功应用于血清中DNA甲基转移酶的检测。不同于前面所提出的免固载型电化学生物传感策略,该免固载型电化学生物传感平台无需昂贵的电活性分子标记,降低了分析成本。此外,自制的微电极具有微型化、快速响应、可重复使用和即插即用的优点,在临床检测中具有很大的应用潜力。