引言多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)作为胶质瘤中最具侵袭性的肿瘤类型,其恶性程度极高,约占成年人的原发中枢神经系统肿瘤的25%,属于预后极差、恶性程度极高的颅内肿瘤之一。治疗GBM的最大困难是该肿瘤存在的部位特殊、与正常脑组织交织不清、手术无法完全清除由GBM所产生的大量肿瘤细胞,以及多样性肿瘤基因所致复杂信号通路活化而形成的肿瘤微环境,从而引发GBM的高复发率和高死亡率。针对GBM肿瘤细胞本身的多种治疗手段的失败,探寻新的治疗策略显得迫切需要。近来,肿瘤所处的微环境成为人们关注的焦点。开发针对肿瘤微环境(Tumor environment TME)的抗肿瘤药物对于延长胶质母细胞瘤患者生存期,改善预后具有重要意义。南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb)是卫矛科南蛇藤属的落叶木植物,是我国中医药学中重要的药用植物,其茎、根、叶和果均可入药,具有祛风活血和解毒散淤之功效。本课题组所使用的南蛇藤茎的乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extact,COE)及制备方法已获得发明专利授权(专利授权号:200710025343.3)。课题组前期研究中发现COE能够抑制肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤细胞生长并诱导凋亡,但是国内外尚无关于COE针对胶质瘤方面的研究。本课题拟在课题组前期研究的基础上,选择人胶质母细胞瘤U87和U251细胞株,通过体外研究探索COE对胶质母细胞瘤的抑制增殖、诱导凋亡的分子作用机制;以及COE对胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭的抑制作用和相关分子机制;模拟肿瘤微环境体外建立胶质母细胞与M2样巨噬细胞共培养模型,研究COE通过CSF-1/IL-34/CSF-1R信号通路对肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages TAMs)的作用,并通过TAMs而间接抑制了胶质母细胞瘤的增殖、诱导凋亡。通过本课题研究,将初次探索COE对胶质母细胞瘤的抗肿瘤作用机制,以及COE对肿瘤微环境中的TAMs的影响,为靶向肿瘤微环境,开发新型多靶点抗胶质瘤中医药提供新的治疗策略及理论依据。本课题将按照下列三个部分进行研究:第一部分:南蛇藤茎提取物对人胶质母细胞瘤U87和U251细胞迁移、侵袭性的影响和分子机制研究目的:研究南蛇藤乙酸乙酷提取物(Celastrusorbiculatusextract,COE)对人胶质母细胞瘤U87和U251细胞的迁移侵袭的影响。方法:体外采用MTT法检测COE对细胞活力的影响;黏附实验方法检测细胞与细胞基质I型胶原的黏附能力;Transwell小室法以及划痕实验检测COE对U87和U251细胞迁移和侵袭能力的影响;Western Blot法检测COE对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白表达的影响;明胶酶谱法检测 COE 对基质金属蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinases-2,9 MMP-2,9)表达的影响;以及采用激光共聚焦显微镜来观察TRITC标记的COE对肌动蛋白装配的影响。研究结果均与阴性对照组比较。结果:1、COE具有抑制胶质母细胞瘤细胞活力的作用,且呈浓度、时间依赖;2、COE能明显抑制人U87和U251细胞的黏附、迁移和侵袭能力,呈剂量依赖;3、COE能降低U87和U251细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达,并抑制其对基底膜的水解;4、COE能下调EMT的标志蛋白N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平,同时能够上调E-钙黏蛋白的表达,COE能抑制胶质母细胞瘤EMT进程的作用,且存在明显的剂量相关依赖性;5、COE能显著抑制胶质母细胞瘤的肌动蛋白装配。结论:COE通过显著抑制人胶质母细胞瘤U87和U251的EMT进程,以及抑制基质水解酶MMPs的活力,影响胶质母细胞瘤肌动蛋白的装配,从而抑制GBM黏附、迁移和侵袭。第二部分:南蛇藤茎提取物影响人胶质母细胞瘤细胞株U251的增殖和凋亡及其机制的研究目的:通过对南蛇藤茎乙酸乙酯提取物COE抗人胶质母细胞瘤U251细胞株的增殖和凋亡作用的研究,初步探讨COE抗胶质瘤的分子作用机制,为寻找新型多靶点治疗胶质母细胞瘤的药物提供理论依据。方法:课题选择人胶质母细胞瘤细胞株U251为研究对象,分设空白对照组和COE药物干预组,应用噻唑蓝染色法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)观察COE对细胞活力的抑制作用;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine BrdU)标记检测COE对U251细胞增殖的影响;采用Annexin V/PI双标法观察COE对U251细胞凋亡的影响;在透射电镜下观察经过COE干预作用后U251细胞的超微结构变化;Westernblot法检测COE对凋亡标志基因Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表达的影响。结果:1、COE具有抑制U251细胞活力的作用,且呈浓度依赖性,U251细胞ICs0浓度为107.1μg/mL。2、与空白对照组比较,当COE的质量浓度分别为40、80、160μg/mL时,可见COE组的细胞增殖明显受抑,随着COE浓度的递增对增殖的抑制作用亦递增,呈浓度依赖性;3、与空白对照组比较,质量浓度40、80、160μg/mLCOE组早期凋亡率6.8%、20.1%、38.4%。而晚期凋亡率分别为5.4%、24.3%、43.6%,呈浓度依赖性。4、透射电镜下观察,COE干预组较对照组,细胞体积固缩,细胞核内染色质溶解,线粒体肿胀,空泡增多,部分细胞出现凋亡小体;5、随着COE的药物浓度增加,其Caspase-3表达量增加,结果与对照组比较,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。结论:COE有效抑制了胶质母细胞瘤U251细胞株的增殖,能促进肿瘤细胞凋亡,并呈浓度依赖性。其作用机制与通过调节Bcl-2、Bax和Caspase-3表达,激活线粒体的凋亡通路有关。COE具有抑制胶质母细胞瘤的增殖和诱导凋亡作用,故对控制肿瘤细胞生长,改善胶质母细胞瘤患者的预后具有及其重要的意义。第三部分:南蛇藤茎提取物通过CSF-1/IL-34/CSF-1R通路作用肿瘤相关巨噬细胞进而影响胶质母细胞瘤增殖及凋亡的机制研究目的:揭示CSF-1/IL-34/CSF-1R信号通路在人胶质母细胞组织中的表达,探索其作用机制及其临床意义;在体外共培养模型观察结果的基础上,研究COE能否作用于CSF-1/IL-34/CSF-1R通路靶向TAMs,进而影响U251细胞增殖和凋亡;并通过BALB/c裸鼠建立皮下异种移植瘤模型,探索COE是否作用于TAMs进而影响肿瘤相关巨噬细胞,从而干预COE的病理进程。方法:采用免疫组化及PR-PCR的方法检测45例临床手术切除后并经过病理证实的胶质母细胞瘤标本以及8例对照组标本,观察CSF-1R、IL-34、CSF-1在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况;通过PMA以及IL-4诱导THP-1细胞向具有TAMs极化分型特点的M2样巨噬细胞分化,并观察其细胞形态、细胞表面标记以证实;采用免疫荧光染色检测CSF-1R、IL-34、CSF-1在U251及M2样巨噬细胞表达和分布情况;以分别为20,40,80,160μg/mL不同质量浓度的COE作用于共培养体系中M2细胞作用24h后,采用实时荧光定量PCR技术检测CSF-1R、IL-34、CSF-lmRNA表达情况,找出COE对集落因子通路作用的可能靶点;应用CRISPR/CAS9双载体的慢病毒技术构建IL-34敲除THP-1的细胞株。PMA及IL-4诱导IL-34敲除THP-1细胞,分化为IL-34敲除M2巨噬细胞;予以COE80μg/mL及替莫唑胺40μM分别作用于不同分组的U251细胞24小时后,以流式细胞仪(FITC-PI双染及BrdU掺入法)检测U251细胞增殖和AnnexinV凋亡的变化;按照2:1的比例,分U251+野生M2、U251+IL-34KOM2异种移植至裸鼠皮下建立模型鼠,成瘤后随机选取各组半数模型鼠予COE灌胃治疗3周,对照组给PBS灌胃,体内观察COE对胶质母细胞瘤的抑制作用。结果:临床组织标本免疫组织化学及RT-PCR结果显示CSF-1R、IL-34、CSF-1在瘤组织的表达远高于对照组非瘤组织,提示肿瘤相关巨噬细胞中CSF-1/IL-34/CSF-1R通路表达,肿瘤组织募集巨噬细胞。PMA及IL-4诱导后的THP-1细胞由悬浮细胞状态转变为贴壁细胞,细胞表面标记CD 68及CD163均呈阳性,提示THP-1转化为M2样巨噬细胞。将THP-1与胶质母细胞瘤U251经Transwell小室间接共培养后,免疫荧光染色结果显示出在该共培养体系中,CSF-1/IL-34/CSF-1R通路相关蛋白仅在M2样巨噬细胞表面表达,不同浓度的COE作用后,经RT-PCR检测显示COE抑制U251后,CSF-1/IL-34/CSF-1R通路活化,CSF-1R与CSF-1mRNA同步表达,而IL-34mRNA表达量与COE呈浓度依赖性,反映出IL-34是一种CSF-1R非依赖性配体。经COE干预共培养体系结果显示U251增殖细胞比例32%明显高于单U251组21%,说明M2巨噬细胞对肿瘤细胞具有保护作用。而U251+IL-34 KO共培养+COE组增殖细胞比例为19.4%,以及U251+IL-34KO共培养+TMZ增殖细胞比例为17.2%,两者间比较统计学意义不明显,说明COE不是通过IL-34影响胶质母细胞瘤的增殖。U251+COE组的凋亡比例22.85%与共培养U251+COE组凋亡比例15.29%两者间存在显著性差异,说明COE能够通过TAMs间接影响U251细胞的凋亡;U251+IL34 KO M2共培养+COE组凋亡比例12.96%与U251+M2+COE组凋亡比值15.9%存在统计学差异,以及U251+IL-34 KO M2共培养+TMZ组凋亡比值8.26%,亦存在统计学差异,说明COE是通过该通路中的IL-34干预TAMs进而发挥靶向抗肿瘤作用。结论:COE通过影响CSF-1/IL-34/CSF-1R通路间接抑制和促进U251细胞凋亡,其作用靶点为IL-34。体内外实验结果均提示COE通过作用于肿瘤微环境中TAMs,而表现抗胶质母细胞瘤生长的药理作用。