烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT,Nicotinamide phosphoribosyltransferase),主要由491个氨基酸组成,其分子量为55 k Da,晶体结构显示为二聚体形式存在的II型磷酸核糖转移酶。NAMPT具有广泛的生物学功能,除了调节脂质代谢、促进血管平滑肌细胞分化成熟、促进前B细胞增殖分化、参与机体炎症反应、抑制中性粒细胞凋亡等作用外,其最主要的功能就是作为生物体内NAD合成的限速酶。近年来大量研究表明,NAMPT是一种很有前景的抗肿瘤靶点,在多种肿瘤细胞中NAMPT为过表达的并与肿瘤的发生发展都成正相关性;与此同时,在脑卒中的保护中,NAMPT也是至关重要的,其直接产物NMN对于脑卒中有很好的保护作用。因此,开发基于NAMPT为靶点的小分子抑制剂和激活剂,对治疗肿瘤和脑卒中都起着至关重要的作用,而目前针对于NAMPT的小分子化合物的开发还处在起步阶段,对于研发临床药物而言,仍需要大量结构多样的NAMPT小分子化合物作为基础。本论文以开发新型结构NAMPT抑制剂和激活剂为主要研究方向,以基于NAMPT为靶点的高通量筛选检测技术为研究手段,着重进行全新结构的NAMPT抑制剂和激活剂的发现、优化及其机制研究。一、基于非Chemdiv化合物库进行抑制剂的筛选、化合物优化及其机制研究应用基于NAMPT特异性靶点的高通量筛选检测技术,我们获得了一个活性很好的NAMPT抑制剂MSO(中国专利号:ZL201110447488.9),其体外离体酶活性为(IC50=9.87±1.15 n M),并且能够抑制包括肿瘤干细胞样的多种肿瘤细胞的增殖。我们对MSO经过构效分析研究后,合成了一系列高活性的MSO结构类似物。这些抑制剂能够特异性地结合NAMPT,而不是其下游靶点NMNAT。我们首次提供了一个化学实例,应用新近报道的细胞热转移分析技术,分析了化合物在细胞内和细胞外造成活性差异的原因,例如由于MS7化合物在活体细胞中的靶点富集作用很差,使得其在体外离体酶活性实验中显示出了最好活性(IC50=0.93±0.29 n M),但是在细胞水平上其活性很差。通过对NAMPT活性酶的点突变研究以及晶体的培养,我们确认了抑制剂的结合模式及其重要的作用氨基酸残基。本研究为更深层次地了解NAMPT抑制剂分子作用模式和未来的抗肿瘤药物研发奠定了基础。二、基于Chemdiv化合物库进行抑制剂的筛选及其机制研究在研发抗肿瘤药物中,需要大量新型的结构多样的NAMPT抑制剂。在使用基于NAMPT靶点的高通量筛选检测平台时,针对于有3万个化合物组成的Chemdiv化合物库进行筛选,我们发现了两个活性较好的化合物,分别是非荧光性化合物F671-0003(IC50=85.05±6.42 n M)和荧光性化合物M049-0244(IC50=170±12 n M)。这两种化合物能够有效地抑制Hep G2细胞系的增殖,并且显著地降低细胞内NAD水平。外源性地加入NMN,能够补救对于HepG2的增殖抑制作用。构效分析的研究结果显示了化合物F671-0003的分子作用模式,并且发现氢键作用力,疏水性作用力和π-π作用力对于化合物的结合是非常重要的。另一方面,成像研究显示了荧光性化合物M049-0244在3μM的浓度下,能够显著地染色HepG2中的NAMPT,并且在经过4 h后,仍能够检测到荧光。我们通过RNA干扰技术和对NAMPT过表达小鼠的研究,确认了该化合物的荧光特异性。本部分研究发现了一个具有全新结构类型的抗肿瘤先导化合物,并且首次应用荧光探针进行NAMPT检测。三、基于化合物库进行NAMPT潜在激活剂的筛选及其机制研究应用基于NAMPT为靶点的高通量筛选检测平台对Chemdiv化合物和非Chemdiv化合物两个化合物库进行筛选,发现有潜在激活NAMPT作用的化合物共495个,通过初筛复筛最终选出4类结构类型的化合物,对NAMPT有潜在的激活作用,可以作为研发NAMPT激活剂的备选化合物。综上所述,本研究针对由54434个小分子化合物组成的化合物库,应用自主建立的基于NAMPT为靶点的高通量检测技术,对NAMPT小分子化合物进行了高通量筛选,在抑制剂方面选出了多个系列新型NAMPT抑制剂,特别是,具有全新结构类型的化合物MSO和具有NAMPT荧光探针作用的化合物M049-0244,并以MSO为基本结构,合成优化了46个结构类似物,深入探讨了他们的构效关系和分子机制;在潜在NAMPT激活剂筛选方面,选出了4类结构可作为研发NAMPT激活剂的备选化合物。本论文NAMPT小分子活性化合物的发现及进一步作用机制的研究,为未来的抗肿瘤药物和脑卒中保护药物的研发奠定了基础。