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捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylide)血矛属(Haemonchus)线虫,分布较广,寄生于反刍动物第四胃和小肠,因吸血可导致贫血和衰弱,引起幼龄动物,尤其是羔羊死亡,对畜牧业造成极大经济损失。多年来,苯并咪唑类药物一直是防治本病的主要化学药物之一。但使用次数过频以及剂量不合适使线虫对该类药物的抗性日益成为世界各地牛羊线虫防治的重要问题。如何快速、准确检测虫体药物抗性受到人们的关注,我国在该领域的工作开展甚少。为此,本文主要开展了以下工作: 1.捻转血矛线虫澳大利亚BZ抗性虫株和我国新疆虫株β微管蛋白基因组DNA片段的克隆、分析及虫卵孵化试验 根据GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因序列设计1对引物,分别以捻转血矛线虫澳大利亚苯并咪唑类药物抗性虫株和我国新疆石河子虫株基因组DNA为模板,采用PCR技术,得到大小约为798bp的产物;将目的片段克隆测序发现:4个序列与GenBank登录序列同源性在90.6-95.1%之间。第200位氨基酸残基密码子在澳大利亚虫株为TAC(酪氨酸),新疆虫株为TTC(苯丙氨酸)。进一步将新疆虫株第200位氨基酸密码子所在的第5外显子PCR扩增克隆测序,与上述测序结果一并分析表明:澳大利亚两个序列与GenBank公布序列尽管核苷酸同源性略有差异(同源性为98.5%),但推测出的氨基酸序列完全一致。新疆虫株3个序列同样如此,只有第200位氨基酸不同;此外,还存在一种TCC(丝氨酸)基因型。对这两个虫株用虫卵孵化试验(Egg hatch assay)进行生物学检测表明,澳大利亚虫株丙硫苯咪唑ED50达0.54ug/ml,为抗药性虫株;新疆石河子株为0.0023 ug/ml,为敏感虫株。 2.多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因方法的建立 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β管蛋白基因组DNA序列(X67489)设计2对引物,利用前期构建的两个重组质粒pMD18-T-AuF1和pMD18-T-XJF1为模板,选择合适的引物浓度和比例以及Taq酶,确定所需雌雄虫模板量,从而优化和稳定PCR反应条件,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法。用澳大利亚抗性虫株做阳性对照,用上海敏感虫株做阴性对照,进行多重PCR反应,琼脂糖核酸电泳图谱表明:澳大利亚虫株表现有F1和F3条带,为抗性图谱,上海敏感虫株只有F2和F3片段,为敏感图谱,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性。用