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背景和目的：miRNA(microRNA)是一些长度很短的非编码RNA,通过降低靶基因的稳定性或抑制其翻译水平来影响细胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明(?)niRNA对于成骨起到重要作用。关于其在成骨发生发展中所起的作用,已经日益成为研究的热点,本课题采用LC公司最新版μParafloTM miRNA基因芯片检测弥漫性特发性骨质增生症(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis, DISH)黄韧带骨化(ossification of ligament flavum, OLF)细胞中差异表达的miRNAs,筛选DISH相关成骨miRNAs,并采用Realtime-PCR验证芯片结果的准确性,生物信息学分析其作用靶基因,探讨其在DISH发生发展中的作用,研究结果为探明miRNAs调控DISH发生的机制,及今后研究其预后指导价值提供理论指导和实验依据。方法：收集4例弥漫性特发性骨质增生症(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis, DISH)黄韧带骨化组织标本和4例正常黄韧带组织标本,正常黄韧带组织标本作为正常对照,分别行细胞培养,并进行免疫荧光鉴定。用Trizol法抽提组织标本总RNA,并进行质量鉴定。YM-100微离心滤器富集小RNA,含875个探针的μParafloTM miRNA微阵列基因表达芯片检测DISH黄韧带骨化细胞(OLFD）和正常黄韧带细胞(LF)miRNA表达谱。利用TaqMan miRNA Assays定量PCR试剂盒,以snoRNA234和snoRNA202作为内标,对部分差异表达的niRNAs进行实时定量PCR检测。根据miRNA芯片检测结果,取筛选得到的DISH组织差异表达niRNAs,基于PicTar2005、miRandaV5和TargetScan 5.1数据库,进行靶基因预测,得到差异miRNAs调控的靶基因。取差异miRNAs调控的特异性表达的基因进行功能显著性分析,基于Gene Ontology数据库,对靶基因进行功能注释,同时,基于数据库KEGG,对差异miRNAs调控的这部分基因进行Pathway注释,得到靶基因参与的所有Pathway。取显著性GO和Pathway分析所属的基因和差异miRNAs,基于miRNAs与基因的属性,利用两者之间的调控关系,构建microRNAs与基因的调控网络。基于patser程序,预测转录因子结合位点。结果：获得黄韧带骨化细胞(OLFD)和正常黄韧带细胞(LF),免疫荧光显示OLFD为成骨性细胞,LF为成纤维细胞。DISH黄韧带骨化细胞(OLFD)和正常黄韧带细胞(LF)的miRNA中共有15个存在明显差异,其中12个高表达和3个低表达,RT-PCR结果显示miRNA芯片结果与定量RT-PCR结果一致,说明芯片结果真实可靠。差异表达的5个niRNA的靶基因有67个,对靶基因进行Gene Ontology(GO)和Pathway的显著性分析,得到了相应的显著性的GOs和Pathways及其所属的基因。pathway分析发现多个通路与骨化有关(MAPK通路、Wnt通路、TGF-β通路、Focal adhesion)。GO分析发现靶基因参与多种分子功能(molecular function),生物过程(biological process)和细胞组成(cellular component),参与DISH的发生,转录因子结合位点预测也提示差异miRNA的靶基因与骨化有关。结论：1.黄韧带骨化细胞为成骨性细胞,正常黄韧带细胞为成纤维细胞；2.建立了DISH黄韧带骨化组织miRNA的表达谱,相对于正常黄韧带组织初步筛查出15个,其中12个表达上调和3个表达下调的miRNAs; 3采用实时定量PCR技术,验证了筛选得到的6个差异表达miRNAs,证明芯片结果准确可靠；4.发现了本研究5个：miRNAs的67个靶基因,它们靶点非常广泛,涉及到细胞周期调控,细胞分化,转录调控等,部分靶基因在促骨化作用中起到了直接作用或者间接的作用,而这5个miRNAs基因在DISH的发病机制中可能发挥潜在的促进或抑制成骨的作用；5.多个通路(MAPK通路、Wnt通路、TGF-β通路、Focal adhesion)可能参与DISH成骨过程。