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本文主要从以下两个部分展开论述： 第一部分:血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26免疫保护作用的研究 目的:大量提取并纯化pIRES-Sj97-Sj14-Sj26质粒,并用此质粒肌注免疫BALB/c小鼠,研究其免疫原性及免疫保护作用,为日本血吸虫病的防治寻求新的多基因组合疫苗的免疫策略。 方法:大量提取并纯化pIRES-Sj97-Sj14-Sj26质粒,并用此质粒肌注免疫BALB/c小鼠,同时设生理盐水组和空载体为对照,每组20只小鼠。每隔2周加强免疫1次,共免疫3次,末次免疫2周后,每组随机取10只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞。以ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清中总IgG抗体及脾淋巴细胞培养上清干扰素(IFN)-γ的水平,以淋巴细胞刺激指数(SI)反应细胞增值能力,以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,并以FCM分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下每只小鼠经腹部感染40土1条尾蚴,尾蚴攻击感染45 d后,经肠系膜静脉灌注法和压片法收集血吸虫成虫,留取肝脏备用。分别计算每只小鼠中收集的血吸虫成虫数,计算每组小鼠的平均成虫数,按下式计算减虫率:减虫率=(对照组平均获成虫数-实验组平均获成虫数)/对照组平均检获成虫数×100％。称取鼠肝总重量,按常规方法用5%氢氧化钾消化肝组织,计算每克肝组织虫卵数(EPG),按下式计算减卵率:减卵率=(对照组平均EPG-实验组平均EPG)/对照组平均EPG×100%。 结果:免疫小鼠后 ELISA法检测抗体结果表明pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗组较各对照组诱导产生高水平的IgG抗体(P<0.01,P<0.05).该组的脾淋巴细胞刺激指数较各对照组也有显著增高(P<0.01),INF-γ的水平与其他两个对照组有显著差异(P<0.01)。CD4+和CD8+细胞百分比有明显增高(P<0.01)。实验组小鼠NO含量较对照组明显提高(P<0.05)。实验组小鼠减虫率39.9%和减卵率43.94%均较对照组明显升高(P<0.01) 结论:pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有较强的免疫原性,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应,并能诱导小鼠产生一定水平的抗日本血吸虫感染的保护作用。 第二部分:日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌BL-21中的表达 目的:构建含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的原核表达质粒pET-Sj14,并将其引入大肠杆菌BL-21中的表达,为制备亚单位疫苗和检测特异性抗体和特异性细胞因子提供抗原。 方法:利用PCR技术扩增日本血吸虫大陆株脂肪酸结合蛋白基因的cDNA序列,经BamH I和EcoR I双酶切后定向克隆于原核表达质粒pET-28a,构建成pET-Sj14质粒,并将此质粒转化大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导蛋白表达,设置空菌对照组和0h,1h,2h,3h,4h共6组,通过SDS-PAGE观察蛋白表达及表达量与诱导时间的关系。 结果:成功构建原核表达质粒 pET-Sj14,并转化至大肠杆菌BL-21, SDS-PAGE显示经IPTG诱导之后成功表达出约24.8kD左右的融合蛋白,且蛋白的表达量在我们设置的时间段内随诱导时间增加而递增。 结论:成功地表达了Sj14抗原,为亚单位疫苗的研究及特异性抗体和特异性细胞因子的检测奠定了基础。