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对氧磷酶3(Paraoxonase3,PON3),是对氧磷酶家族中发现最晚,研究最少的一员。PON3同PON1在结构和性质上有较高的同源性和相似性,两者均具有内酯酶活性和抗氧化活性,均可以抑制LDL的氧化修饰并水解已经氧化的LDL,有体外实验证明PON3比PON1的抗氧化活性更强。另外有报导表明,PON3具有抗炎作用,与肠道炎症有直接关系。CCl4诱导肝损伤的作用机制主要是自由基的形成及其引发的链式过氧化反应,炎性因子的积累和肝细胞的凋亡可能也在CCl4诱导的肝损伤过程中起重要作用。因此,提高机体清除自由基的能力,抑制炎性因子的产生,抑制肝细胞的凋亡可能有效降低肝损伤的程度。迄今为止,PON3对肝损伤的保护作用还未见报道。本文中,我们以CCl4诱导小鼠急性肝损伤为模型,首次采用两种不同的基因转移策略研究了人PON3在小鼠体内过量表达对肝损伤的保护作用,并从抗氧化,抗炎症和抗凋亡三个方面对其机制进行了探索。
首先,构建真核表达重组质粒pCI-hPON3,以pCI-hPON3裸DNA为载体经电刺激介导使hPON3基因转移到小鼠骨骼肌中表达,分析hPON3在骨骼肌中的表达情况。实验数据显示电转移hPON3在小鼠肌肉中可有效表达,并部分分泌入血,使血清中hPON3内酯酶活性明显升高,升幅最大约40％。在腹腔注射CCl4诱导的急性肝损伤小鼠模型中,发现hPON3的转基因表达对CCl4诱导的急性肝损伤有明显的保护作用。小鼠血清转氨酶(ALT,AST)活性检测和肝脏病理切片结果表明,hPON3转基因表达显著减轻了CCl4引起的急性肝损伤症状。此外,hPON3表达显著降低了肝脏的MDA水平,提高了自由基清除剂GSH含量和总抗氧化能力,说明hPON3参与了氧化压力的调节,其抗肝损伤的能力与抗氧化作用有关。因此推测PON3对肝脏的保护作用可能与PON1类似,与它能够抑制脂质过氧化及水解已经形成的过氧化脂质的性质有关。
为进一步提高hPON3的转基因表达效果和深入研究PON3对肝损伤的保护作用机制,我们采用腺病毒为载体介导hPON3基因在小鼠肝脏中转基因表达。重组腺病毒介导hPON3在小鼠肝脏中的表达与电转移法相比转基因效率和表达水平更高,且表达产物集中于肝脏,对肝损伤的保护作用更为直接。我们构建了Ad-hPON3重组腺病毒,经尾静脉注射5×108pfu/只剂量,使hPON3在小鼠肝脏过表达,发现表达的hPON3主要集中在肝脏细胞内发挥作用,几乎不分泌入血。小鼠尾静脉注射Ad-hPON3后第二天即可在肝脏中检测到hPON3mRNA的明显表达,第7天达到峰值,并延续14天以上。腹腔注射CCl4诱导急性肝损伤后,Ad-hPON3治疗组与Ad-lacZ对照组相比,血清ALT,AST的值显著降低,相应的病理切片结果也表明肝损伤的程度明显减轻。肝脏脂质过氧化终产物MDA的含量显著降低,T-AOC和GSH的含量明显升高,与电转染的结果基本一致,说明Ad-hPON3对肝脏的直接感染扣hPON3的过表达显著降低了肝脏的氧化压力,有效地减轻了CCl4诱导产生的肝损伤的程度。实验还发现在CCl4注射后,Ad-hPON3转基因组小鼠血清中TNF-α、IL-1β与Ad-lacZ对照组相比有极显著的降低,表明腺病毒介导的hPON3在肝脏的过表达能有效抑制CCl4诱导的炎症反应,这可能是PON3抗肝损伤的另一机制。此外,Ad-hPON3转基因组的TUNEL阳性细胞数显著少于Ad-lacZ对照组,凋亡指数显著降低,说明PON3在肝脏的过表达也能显著抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡,这种抗凋亡作用可能也是PON3发挥防止肝损伤的机制之一。此外,设立Ad-hPON1重组腺病毒组,对PON1和PON3抗肝损伤的保护作用进行了比较,结果表明Ad-PON1转基因表达组在抗肝脏氧化和抗炎症方面效果优于Ad-PON3转基因组,但是差异并不具有统计学意义(P＞0.05)。
本论文首次系统地研究了hPON3对CCl4诱导的肝损伤的保护作用,并证明了这种保护作用与PON3的抗氧化能力,抗炎症作用和抗肝细胞凋亡作用有关。另外,对PON1和PON3基因的抗肝损伤能力从也做了比较分析。为应用PON3,PON1基因药物防治肝损伤提供了重要的实验依据。