苏云金芽孢杆菌S2480-1特性以及4个ORF的克隆与分析

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苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)S2480-1,是海南省热带农业资源所在黑龙江省凉水自然保护区分离到的野生菌株。光学显微镜可以观察到圆形和扁形的伴孢晶体;SDS-PAGE分析后发现,有三条明显的蛋白质主带,分子量大小大约为:140kDa、100kDa、85kDa。通过跑脉冲场凝胶电泳,发现其有4个质粒,其中Ⅰ型质粒1个,Ⅱ型质粒3个。   本研究采用PCR-RFLP的方法来鉴定该菌株的基因型,PCR反应和酶切分析表明,BtS2480-1菌株质粒中晶体蛋白的基因型是属于cry4-like基因。为了进一步研究BtS2480-1菌株的Cry蛋白基因,本研究构建了1个质粒文库,获得了近4000个克隆子,筛选出4个阳性克隆子,选择编号为L9的克隆子测序,测序获得9290bp的DNA序列。利用生物学软件对该序列进行分析,结果表明,本研究获得的序列中包含序列长度分别为564bp、2220bp、1704bp和1332bp的4个ORF,我们将其对应的编号为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4。   进一步的分析表明,ORF1含有564个碱基,编码188个氨基酸肽段,并且属于CryBP1超家族;已经成功的构建到原核表达菌株BL21(DE3)中,经诱导后已经高效表达。我们认为该蛋白的作用可能与分子伴侣的功能相当,对ORF2的表达可能是必需的。   ORF2预测编码的蛋白在GenBank上的BlastP分析表明,与已公布的Cry蛋白覆盖率都在91%以上,有N端和C端,且同源性均低于35%,也经过国际Bt基因命名委员会初步分析,具有典型的3个结构域的蛋白,初步推测ORF2可能属于第一分类的全新基因,因其蛋白质的表达和活性不清楚,尚不能命名(内部通行)。该基因已经在Genbank中登记,其基因登录号为HM450151。该基因的特性尚待进一步的研究。   关于ORF3和ORF4经过序列分析,二者与已公布的cry基因有一定的相似性,虽然成功的转化入了原核表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中,但是都未能在其中表达,它们还需要进一步的研究。
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