多酶级联反应是复杂生物制品工业开发过程中最重要技术之一,例如药物,化妆品和营养化合物的绿色合成。广泛存在于自然界中的多酶复合体启发了研究人员设计合成类似物,以通过共定位多种功能相关酶来模仿天然多酶复合体的独特协同催化功能,从而提高人工级联多酶催化反应的整体效率。人工多酶复合体多依赖蛋白质工程偶联技术途径实现,例如融合蛋白,酶支架或固定化。多酶催化系统的发展在实际应用中越来越受到经济性和环保要求的推动,这为开发多酶共固定化技术提供了驱动力。在仿生学的尝试中,共固定化旨在将许多顺序的或协同作用的生物催化剂固定在同一功能载体上,以通过优化催化转化来赋予增强反应动力学、转化效率及稳定性等酶学性质。本研究工作集中在建立多酶级联反应和开发基于多酶有序共固定化的新策略,以构建开发用于多酶纳米器件,来实现动力学的增强和对酶的空间排列的强力控制,从而为绿色高效合成高值的萜类糖苷功能分子提供技术支撑。1.设计构建微生物糖基转移酶与植物蔗糖合酶偶联的人工多酶级联催化体系高效制备生物活性甘草次酸糖苷甘草次酸（GA）糖苷衍生物是甘草中一类具有重要生物活性的五环三萜类化合物,在临床实践中已被广泛用作药物配方。由于存在诸如立体异构性差,副反应,效率低和环境污染等缺点,用于GA糖基化合成GA衍生物的化学方法相当复杂。尽管可以通过使用有效的UGT进行体外酶促糖基化来缓解这些缺点,但GA的UGT催化的糖基化需要昂贵的UDP-葡萄糖（UDPG）作为葡萄糖基供体,从而限制了UGT的实际应用。在本研究中,我们从枯草芽孢杆菌中鉴定出一新的糖基转移酶UGT109A3,该糖基转移酶可在大肠杆菌中高效重组过表达,并通过Ni-NTA对其进行了纯化。酶活性分析揭示UGT109A3可以将GA的游离C3羟基和C30羧基糖基化,生成独特的3,30-O-β-D-二葡萄糖苷-GA。为了高效,经济地生产高价值的GA-糖苷,我们构建了人工生物催化级联反应,将微生物UGT109A3与植物蔗糖合酶（SUS）偶联。通过补料分批糖基化,可以从GA酶促转化大规模的GA-葡萄糖苷（4.98 g/L,6.26 m M,8小时）。与母体GA（29μM）相比,所获得的GA-二葡萄糖苷的水溶性显着提高了约3.4×10~3倍。此外,根据MTT分析,其对人结肠癌Caco-2细胞系也表现出剂量依赖性的细胞毒性,IC50为160μM。这项研究不仅建立了生产GA-葡萄糖苷的有效平台,而且为其他复杂萜类糖基化天然产物的进一步生物合成奠定了基础。2.发展多酶有序共固定化策略,构建级联催化阵列增强多酶级联催化性能我们提出了一种快速实现多酶有序共固定化的新策略,该策略基于正反应性裂解肽、聚组氨酸（His）标记的蛋白质以及氮基三乙酸（NTA）修饰表面的Spy Tag/Spy Catcher系统,作为定向且稳定的蛋白质共固定化的一般方法。研究中,我们选取了Spy Catcher片段及其结合伙伴Spy Tag肽分别与UGT51糖基转移酶突变体（UGTm,S81A/L82A/V84A/K92A/E96K/S129A/N172D）和四聚蔗糖合酶（SUS）融合。多聚体融合蛋白自组装成超分子复合物,构成共价键连接的多亚基糖酶级联,在不同糖酶间促进UDP葡萄糖的再生,并将PPD转化为稀有的人参皂苷Rh2。接着,我们通过组分酶丰富的多组氨酸标签将自组装体固定在Ni2+:NTA功能化载体上。我们发现自组装的UGTm-SUS自组装体能快速且稳定地吸附结合于聚苯乙烯微球功能表面上。我们进而对固定化多酶组装体的形貌进行了观测,SEM电镜下发现载体功能表面呈现出着颗粒状的纳米层覆盖,并且颗粒在TEM电镜下呈高度匀质化排列在微球表面。重要的是,酶分析表明,与随机共固定化和游离酶自装体系统相比,有序共固定化UGTm-SUS自组装体的酶活性分别提高了3.8倍和2.3倍,与随机共固定化相比,有序共固定化UGTm-SUS阵列可使UDP葡萄糖的负载量降低3倍。有序共固定的UGTm-SUS阵列不仅显著提高了生物级联催化的固定率和催化效率,而且与随机共固定和游离的多酶自组装体相比,其在UDPG再生,储存稳定性和重复使用性方面也表现出显著改善。这项研究突出了生物催化剂纳米复合的协同优势,并为合理设计有序共固定多酶以提高生物催化级联效率提供了广阔前景。