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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是 20 世纪 80 年代末发现的一种高度传染性疾病,引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍症状,以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道症状,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)。PRRSV是单股正链 RNA 病毒,与马动脉炎病毒、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒和猴出血热病毒同属于最近成立的动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV 基因组长约 15kb,包括 8 个开放阅读框架(ORFs),ORFla 和 ORFlb 编码病毒复制酶,ORF2~5分别编码病毒的糖蛋白 GP2~GP5,ORF6 编码膜蛋白(M 蛋白),ORF7 编码保守性的核衣壳蛋白(N 蛋白)。根据抗原性不同将各地 PRRSV 分离株分为欧洲型(原型毒株为 LV)和北美洲型(原型毒株为 VR-2332)。 囊膜蛋白 GP5 是 PRRSV 的主要结构蛋白和主要免疫保护性蛋白之一,有许多独特的生物学和免疫学功能,在病毒的致病和机体的抗病毒免疫中发挥着重要的作用。因此,我们克隆了 PRRSV 广东株 ORF5 基因,对 ORF5 基因进行了测序,在此基础上构建了 ORF5基因的原核表达质粒 ORF5-pBAD/gⅢ,并在大肠杆菌中进行表达。随后,我们又构建了ORF5 基因的腺病毒表达质粒 pAdCMV-ORF5,对其进行了鉴定。 (1) 原核表达系统 根据已克隆的 PRRSV 广东株 ORF5 的基因序列,设计了能够扩增 ORF5 基因的一对含有KpnⅠ和Xba I双酶切位点的引物,经PCR枝术从pMD-ORF5质粒中克隆出大小为602bp的基因,将此基因克隆到 pBAD-gⅢC 表达载体中,构建了表达质粒 ORF5-pBAD/gⅢC。转化入大肠杆菌 TOP10,用 IPTG 进行诱导表达,结果表达出约 22kD 的融合蛋白,蛋白大小与设计相符,经 Western Blot 免疫印迹分析,该蛋白能与 invitrogen 公司所提供的带六个组氨酸的抗体反应。 (2) 真核表达系统 根据已克隆的 PRRSV 广东株 ORF5 的基因序列,设计了能够扩增 ORF5 基因的一对含有KpnⅠ和Xba I双酶切位点的引物,经PCR枝术从pMD-ORF5质粒中克隆出大小为602bp的基因。将 PCR 产物和腺病毒穿梭载体 pAdTrack-CMV 用 Kpn I 和 XbaⅠ双酶切,经酶切的 ORF5 基因和穿梭载体 pAdTrack-CMV 连接后用热激法转化 E.coli DH5α,进行 PCR和酶切鉴定。将获得携有 PRRSV ORF5 基因的重组穿梭质粒线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy 共转染 E.coli BJ5183,使之发生同源重组,经 PCR、酶切鉴定后获得重组的腺病毒质粒,最后用 PacⅠ酶切线性化,与脂质体共转染入 293 细胞,获得含 PRRSV ORF5基因的重组腺病毒。