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前言
磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一个细胞内脂质底物的特异换能器。它可以被多种酪氨酸激酶受体富集和激活,通过对细胞膜上肌醇酯D3位置的磷酸化,产生第二信使参与多种信号通路的调节。PI3K/Akt信号通路对神经元的存活具有重要的保护作用。胰岛素、IGF-1等对中枢神经系统的保护作用可以通过激活PI3K/Akt通路,启动相应的下游信号来发挥作用。PIK3R3是PI3KIA类调节亚基之一,它可与IGF-1R或IRS相互作用,形成含酪氨酸磷酸化的复合体并参与PI3K信号通路调节。此外PIK3R3还有独特的生物学功能,它可以借助N24结构与Rb相互作用,参与细胞周期的调节。
凋亡,又称细胞程序性死亡,对中枢神经系统的发展具有重要作用。半胱氨酸天冬氨酸酶和细胞凋亡的发生发展紧密关联。凋亡被认为是神经退行性疾病中导致神经元丢失的主要机制之一。在神经系统相关的不同细胞系中,异常蛋白的积聚、线粒体的失功能、氧化应激、神经性炎症、以及激酶信号通路调节的紊乱均有可能导致神经元的死亡。
PQ是一个广泛使用的除草剂,它可以用于诱导细胞应激。在实验研究中,PQ的诱导可以产生与PD相似的改变,如活性氧含量的增加、前突触蛋白α-synuclein的积聚以及选择性黑质损伤等。流行病学研究显示农业中PQ的使用与PD的发病率具有相关性。而且已有资料报道PQ可选择性损伤多巴胺能神经元,导致受试动物出现神经行为学症状。本实验用PQ诱导SH-SY5Y细胞来研究PIK3R3的生物学功能以及它在PD发病机制中可能发挥的作用。
材料与方法
1、用Real-time PCR、Western blot方法分析SH-SY5Y中的PIK3R3经PQ诱导后的表达变化;
2、用Western blot和fluorescence方法分析SH-SY5Y经PQ诱导后发生凋亡;
3、用Western blot方法检测不同种类的caspase对PIK3R3的作用;
4、用瞬时转染方法观察全长或N端缺失的PIK3R3在SH-SY5Y及HEK-293细胞中的分布。
结果
1、SH-SY5Y细胞中的PIK3R3经PQ诱导后,mRNA和蛋白水平表达量下降。
2、测序结果确证了重组体序列与参考序列相符,成功构建全长和N端缺失的PIK3R3重组体。
3、抑制caspase通路可以部分恢复PIK3R3的蛋白表达量:全长PIK3R3可被caspase6水解,N端缺失的PIK3R3不能被caspase6水解。
4、全长的PIK3R3主要分布于核内,N端缺失的PIK3R3主要分布于胞浆。
结论
1、在SH-SY5Y细胞中,PIK3R3表达量的下降与凋亡相关,参与PQ诱导的细胞凋亡。
2、PIK3R3的N端含有caspase6的识别序列。
3、PIK3R3定位于细胞核内,其分布特征受N端结构影响。