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研究背景及目的：微小RNA（microRNA、miRNA、miR）是一类长约21-25nt的单链小分子RNA（single-stranded RNA，ssRNA），位于细胞染色体的非编码区，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，即非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），通过调节体内代谢过程而发挥其生物学作用。 miRNA通过与其靶mRNA分子的3’端非翻译区（3’-untranslational region,3’ UTR）互补配对,抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA,从而负性调控靶基因表达。近年来，越来越多的证据表明，miRNA通过下调维持干细胞未分化状态的某些基因，同时激活干细胞谱系特异性基因，调节干细胞的定向分化，如成骨分化、成脂分化等。成骨细胞是骨形成中的一类重要细胞，源于间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）。在MSCs向成骨细胞分化过程中存在多水平的调控机制，多种激素及旁分泌和/或自分泌细胞因子被证实参与这一调节。有文献报道提示miR-125b可能是骨髓MSCs向成骨细胞分化过程中的一个重要调节因子，但具体调节机制还有待进一步探索。因此，本研究旨在探明miR-125b在MSC成骨分化过程中的表达变化，明确其靶基因，初步探讨miR-125b调节MSCs成骨分化的可能机制。方法：1.以miR-125b为研究对象，利用基因芯片检测小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中miRNA表达谱，以未分化细胞为对照组，诱导成骨分化7天(第一组)、14天（第二组）为实验组，分析三组之间miRNA尤其是miR-125b表达差异。另外，利用实时定量RT-PCR检测成骨分化1、3、5天后miR-125b表达结果。2.为明确miR-125b作用靶点，我们通过picTar、miRanda、Targetscan三个数据库进行生物信息学分析，查找miR-125b的潜在靶基因，在miR-125b的众多预测靶基因中，挑选具有成骨调节作用的核心结合因子Cbfβ进行实验验证。3.为了验证Cbfβ3’-UTR是miR-125b作用的真正靶点，我们将预测的Cbfβ3’-UTR靶位点上下游片段进行克隆、突变后，插入PmiR-report荧光素酶表达载体中，以pRL-TK为内参照载体。为了获得足够的最终实验结果信息，根据Cbfβ3’UTR预测结合位点序列合成了：①miR-125b完全互补序列(Perfect Target，PT)，②野生型结合位点序列（microRNA recognition element，MRE），③去掉种子结合区的突变形式结合序列(MRE-mutation，mut)。为增加效能，分别使用2×PT，2×MRE，2×mut，前期文献已证实了这种质粒构建方式的适用性。然后将重组质粒、对照质粒miR-125b mimic或anti-miR-125b共转染293T细胞，48小时后裂解细胞行双荧光素酶报告基因检测。4.在C3H10T1/2细胞中过表达外源性miR-125b和干扰表达内源性miR-125b，48小时后行Western-Blot和RT-PCR检测Cbfβ表达量变化，观察miR-125b对Cbfβ的调控作用。研究结果：1.生物芯片结果显示：①C3H10T1/2细胞诱导分化7天组与未分化组对比：表达量上调分子12个，下调分子30个；分化14天组与分化7天组对比，表达上调miRNA分子92个，下调miRNA分子94个；分化14天组与未分化组对比：表达量上调分子84个，下调分子98个（上调以2倍为下限，下调以0.5倍为上限）。②C3H10T1/2细胞诱导分化7天组和14天组miR-125b表达量与未分化组表达量比值分别为：未分化组/分化7天组/分化14天组=1/0.8710/0.6378.。实时定量RT-PCR检测结果示：C3H10T1/2细胞成骨诱导分化1、3、5天后miR-125b表达量较未分化组明显降低（P<0.05）。2.生物信息学分析结果表明，小鼠种系miR-125b作用靶点共计342个，其中包括在骨形成过程中具有重要作用的核心结合因子Cbfβ，Cbfβ mRNA的3’-UTR含有一个与miR-125b种子序列匹配的潜在结合位点。3.重组质粒pMIR-2×PT，pMIR-2×MRE，pMIR-2×mut经HindⅢ单酶切，琼脂糖凝胶电泳，可于5000-7500bp之间获得目的条带。送大连TAKARA公司测序，结果示碱基序列和设计序列完全一致，重组质粒构建成功。双荧光素酶报告基因检测结果：将PmiR-2×PT与miR-125b mimic或anti-miR-125b共转染293T细胞后，荧光素酶活性有显著减少或增加，证实了双荧光素酶报告基因实验体系的有效性。将PmiR-2×MRE与miR-125b mimic共转染细胞后，荧光素酶表达受到明显抑制，而转染PmiR-2×mut与miR-125b mimic后，荧光素酶表达无明显变化。另外，我们发现将anti-miR-125b与PmiR-2×MRE、miR-125b mimic共转染后，可中和掉miR-125b mimic对PmiR-2×MRE的抑制作用；将anti-miR-125b与PmiR-2×mut、miR-125b mimic共转染后，荧光素酶活性仍无明显变化。实验重复3次，结果有统计学意义（P<0.05）。4. Western-Blot和RT-PCR结果显示：在C3H10T1/2细胞中过表达miR-125b，Cbfβ蛋白和mRNA表达量明显降低；用转染anti-miR-125b的方式抑制miR-125b后，Cbfβ蛋白和mRNA表达量明显升高。结论：miR-125b在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化后表达量降低。Cbfβ是miR-125b的一个靶基因，在C3H10T1/2细胞中，miR-125b可负性调节Cbfβ表达。