【摘 要】
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该研究应用分子生物学等技术研究了OIF的基因表达情况及pit-1转录因子对其启动子区的调控作用,并构建了OIF原核、真核表达载体,获得了OIF的抗体,为进一步揭示OIF是否为垂体分
【出 处】
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上海第二医科大学 上海交通大学医学院 上海交通大学
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该研究应用分子生物学等技术研究了OIF的基因表达情况及pit-1转录因子对其启动子区的调控作用,并构建了OIF原核、真核表达载体,获得了OIF的抗体,为进一步揭示OIF是否为垂体分泌的新激素奠定基础.主要内容和结果如下:一、小鼠及人分泌蛋白骨生成诱导因子基因的表达及定位分析采用ICR品系的清洁级小鼠的组织来提取RNA,以GAPDH为内标,用半定量RT-PCR方法来观察OIF在小鼠各种组织的表达情况.二、人分泌蛋白骨生成诱导因子启动子区的调控分析通过生物信息学技术分析发现在人OIF基因的启动子区域2.5kb的DNA序列中,其第二个转录起始位点上游700~1000bp的范围内有两个Pit-1反应元件,且两个反应元件之间仅相距250bp.利用凝胶阻滞试验(Gel-shift),在体外发现,OIF基因启动子区的两个pit-1转录因子结合位点均能与Pit-i转录因子结合,其中探针1与Pit-1转录因子的结合较强,进一步应用荧光素酶报告基因系统,在体内研究了pit-1转录因子对OIF转录的调控.三、人垂体分泌蛋白骨生成诱导因子原核表达载体构建、表达及抗体制备利用RT-PCR技术从垂体中克隆到人OIF的cDNA序列,构建成OIF核心蛋白的融合蛋白表达载体pGEX-OIF,将此重组表达载体转化人大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核表达.四、人分泌蛋白骨生成诱导因子的真核表达载体的构建及鉴定借助OIF全长cDNA利用PCR技术构建了pcDNA3.1-OIF真核表达载体,此真核表达载体表达的蛋白带有6个Histidine Tag,便于进一步纯化蛋白.通过对重组质粒的单酶酶切、双酶酶切鉴定以及测序表明所构建的序列及读码框架完全正确,这为下一步进行蛋白表达、单克隆抗体的制备及研究OIF对垂体激素旁分泌或自分泌的影响奠定了基础.
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