神经递质类相关物质的毛细管电泳分离及在实际尿液中的检测研究

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毛细管电泳(CE)具有普通电泳和色谱的双重优点,以其高灵敏度、分离模式多、快速、运行成本低、自动化、环保等特点,在临床医学、生物化学、蛋白质组学、环境学、DNA测序、药物分析等领域得到越来越广泛的应用,并逐步成为一种可靠的日常分析方法。毛细管电泳理论与应用研究逐步受到分析化学与生物科学研究者的关注与重视,发展迅猛。本论文采用毛细管电泳紫外检测技术,着重探讨了神经递质类物质分离分析、高灵敏度分析方法;尿液中基体组分对神经递质类物质分离分析的影响,为尿液前处理方法提供参考;并研究了运动员尿液中神经递质类物质含量与运动疲劳的相关性,为运动疲劳生化指标提供了简便、快速的分析方法。具体开展了如下工作:第一章,绪论简要回顾了CE技术的发展历程,介绍了其原理、分离模式、进样方式和检测技术特点,并着重介绍了CE基本理论。根据本论文的研究内容,侧重论述了神经递质类物质在机体内的重要作用及CE技术在神经递质类物质检测及尿液分析中的应用。第二章,采用CE技术开发了对单胺类神经递质(5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素)、神经递质类代谢产物(高香草酸、5-羟吲哚乙酸、香草扁桃酸)、以及神经递质类前体(精氨酸、酪氨酸)混合物的分离方法。利用标准试剂混合样优化了缓冲体系的组成、pH值、添加剂对分离的影响,并考察了尿液中基体成分如肌酸酐、尿酸、乙酰乙酸对分离可能存在的干扰。最终在Na2B4O7-NaOH缓冲体系(pH9.90),紫外(UV)检测(波长200nm)条件下对8种神经递质类相关物质的分析获得了良好的定量线性关系,最低检出限(LOD)在0.04~0.60μmol/L之间,迁移时间和峰面积的重现性(RSD)(n=5)范围分别为0.09%-0.48%及0.47%~3.34%,并利用该CE方法对实际尿液中的精氨酸和香草扁桃酸进行了定性和定量分析,其结果分别为95.8±3.8μmol/L和44.6±3.5μmol/L,加标回收率在96.65%~104.5%间。第三章,单胺类神经递质(5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素)、神经递质类代谢产物(高香草酸、5-羟吲哚乙酸、香草扁桃酸)、神经递质类前体(精氨酸、酪氨酸)及3种尿液基质成分(肌酸酐、尿酸、乙酰乙酸)物质的不同,故在运行缓冲液12.5mM Na2B4O7-NaOH (pH=9.90)中呈现不同的电荷状态,且离子迁移率不同产生较大的电动进样歧视效应。为使这几种样品能同时分离分析,我们利用正电压先进样品再用压力法进一段水区带,接着转换电极极性进一段时间样品。该方法的成功关键在于控制水区带与样品区带长度比。经实验研究表明,在Na2B4O7-NaOH缓冲体系(pH9.90),紫外(UV)检测(波长200nm),8kv进样30s、0.5psi进超纯水20s、-8kv进样40s的进样条件下对8种神经递质类相关物质及3种尿液基质成分能同时分离分析,其最低检出限(LOD)在0.003~1.0μmol/L之间,迁移时间和峰面积的重现性(RSD)(n=5)范围分别为0.33%~4.10%和6.41%~37.71%。第四章,采用CE-UV技术探索不同离子强度的背景液中对单胺类神经递质(5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素)、神经递质类代谢产物(高香草酸、5-羟吲哚乙酸、香草扁桃酸)、以及神经递质类前体(精氨酸、酪氨酸)混合物的分离及进样量的影响,并建立快速、灵敏的检测方法。通过在模拟尿液中对神经递质类痕量物质分析,在接近真实尿液条件下了解尿液中的基体成分对神经递质类物质分离的具体影响。该法的目的是研究在高盐含量的生物样品中,在电动进样方式下,相同的混合标准溶液在不同离子强度的背景下,探索是否有利于降低分离毛细管内电势降造成的组分歧视,并将该法用于人体尿液神经递质含量的研究分析中并为尿液的前处理方法做初步的研究。实验结果表明,尿液中有机物组分使8种神经递质类物质进样量减少50%~95%,而Na2SO4、K2HPO4、NH4Cl等无机盐组分有利于降低电动进样组分歧视效应,使得pKa<9.90的神经递质类物质进样量增加,但其他无机盐组分使得8种神经递质类物质进样量均降低50%~90%。第五章,采用CE技术分析运动员在疲劳前后尿液中的代谢产物含量的变化,主要对尿液中的神经递质类(5-羟色胺、多巴胺、肾上腺素)、神经递质类代谢产物(5-羟吲哚乙酸、高香草酸、香草扁桃酸)、神经递质类前体(精氨酸、酪氨酸)及主要基体成分(肌酸酐、尿酸、乙酰乙酸)进行定性定量分析。选择主观疲劳等级(RPE)、换气比值、最大摄氧量等方法评估运动员运动前、疲劳后、恢复后三种生理状态,本文对RPE值超过18的5名运动员的三种生理状态下尿液中神经递质类组分进行定性定量分析,结果表明,这5名运动员尿液中的精氨酸在运动疲劳后含量比训练前降低10.6%~62.2%,高香草酸的含量比训练前升高2.75%~36.42%。
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