研究背景:多糖(polysaccharide)是由十几个甚至上千个单糖分子缩合、失水而成,是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。其性质已大不同于单糖,如甜味已经基本消失,广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中,是构成生命的四大基本物质之一,与生命功能的维持密切相关。按来源分类,可分为真菌多糖、细菌多糖、藻类地衣多糖、高等植物多糖、动物多糖五大类。多糖是重要的生物活性大分子,大量研究表明,多糖具有明显的生物活性,如调节免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、抗氧化、保肝护肝等作用。多糖的研究近年来受到越来越广泛的关注,多糖成为继蛋白质、核酸后生命科学的又一大领域。甘蔗是禾本科甘蔗属(Saccharum L.)植物,原产于热带、亚热带地区,是一种一年生或多年生宿根高光效的C4植物。目前,国外已有甘蔗多糖的相关研究,而国内对甘蔗中多糖的研究起步较晚。目前主要是从甘蔗叶、甘蔗滓中获取多糖成分,在提取的方法上也有较多的探索。早期对甘蔗滓多糖的活性研究表明甘蔗滓多糖具有降血糖作用。近年,研究表明甘蔗滓多糖有显著提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用;甘蔗叶多糖具有较强清除· OH的能力,对· OH致DNA损伤具有良好的保护作用;甘蔗叶多糖对人鼻咽癌CNE2细胞的生长有抑制作用,且呈明显的剂量依赖关系,说明甘蔗叶多糖具有体外抗肿瘤活性。甘蔗滓是制糖工业的主要副产品,是甘蔗机械压制后所剩的主要部分,属于农业固体废弃物中的一种。我国有多个省份种植甘蔗,海南、广东、广西、福建、云南都是我国重要甘蔗种植区和重要产糖省份,每年均有大量的甘蔗滓产生,多数没有得到有效的高值化利用。寻找高值化的途径综合利用甘蔗滓具有重要意义。研究发现甘蔗滓中所含多糖具有较强的免疫增强、保肝、抗肿瘤作用。本项目研究拟在前期工作的基础上,进一步进行甘蔗滓多糖的综合利用开发研究,完成其精制、纯化、结构鉴定、理化性质等工作,期望能够按五类新药要求完成部分临床前研究资料,同时将之用于饲料添加剂行业,开发形成一个新型的饲料添加剂。本项目的研究变废为宝,即增加一个五类新药及新型的饲料添加剂,又减少环境污染、节能减排,项目所开发新药产品的适应症发病人群广,市场大;所开发饲料添加剂与同类产品相比具有低成本的特点。项目一方面可以提高糖厂的经济效益,还可以为畜牧业提供大量的成本低廉的饲料添加剂来源,降低了添加剂来源成本,对发展节约环保型、生态友好型产业,具有重大意义。并可间接为建设农村工业、发展农业经济,提高农民收入的“三农”模式起到促进作用。研究目的:1.对甘蔗滓多糖提取过程中的脱脂、脱蛋白工艺进行研究。采用均匀设计法对甘蔗滓多糖脱脂工艺进行筛选,对比Sevage法和酶法脱蛋白效果,确定优化的甘蔗滓多糖提取工艺。2.甘蔗滓多糖的提取精制。甘蔗滓脱脂后采用水提醇沉法提取多糖,并经过脱蛋白、脱色及透析对其进行精制。3.分离纯化甘蔗滓多糖。采用DEAE-52纤维素柱,对甘蔗滓多糖进行分离。采用凝胶过滤法,用Sephadex G100凝胶、Sephacryl S300凝胶对所得的多糖组分进行纯化。用SephacrylS300凝胶对两种多糖组分进行纯度验证。4.研究分离纯化所得的两种多糖组分(SRP1、SRP2)的分子量及结构鉴定。5.研究甘蔗滓粗多糖对于大鼠高血脂症的降血脂和护肝活性。研究方法:1.工艺筛选采用均匀设计法,考查乙醇和乙醚比例为0.1～1(即10%乙醇～100%乙醇);提取时间为2～4h;料液比为1:15～1:25(g/L)的脱脂效果,优化脱脂工艺。对比Sevage法和酶法脱蛋白效果,用Sevage法脱蛋白12次确定最佳脱蛋白次数,正交试验优选出酶法最优工艺,将两者进行对比确定甘蔗滓多糖的脱蛋白方法。2.甘蔗滓多糖的提取取一定量甘蔗滓用乙醇、乙醚(1:9)溶液回流4h进行脱脂,滤过,弃去滤液,滤渣依次加10倍量、8倍量水提取两次,每次2h,滤过合并滤液,滤液浓缩,加4倍量95%乙醇,静置过夜,抽滤,滤渣80℃烘干得甘蔗滓粗多糖。粗多糖加水溶解,配浓度1mg/mL溶液,加入1/5体积的Sevage溶液(氯仿:正丁醇5:1)振摇10min,置分液漏斗中,分取上清液,再加入1/5体积的Sevage溶液,重复上述过程8次。脱蛋白后的多糖溶液加30%H2O2(多糖溶液:H2024:l),恒温37℃保温24h。将多糖溶液装于透析袋中,蒸馏水透析72h,每12h换水一次。透析后冷冻干燥得到精制甘蔗滓粗多糖。甘蔗滓多糖提取率为1.02%,多糖的含量为40.00%。3.甘蔗滓多糖的分离纯化将甘蔗滓多糖溶液上样,过DEAE-52柱洗脱,自动部分收集器收集洗脱液。以水和0～0.5mol/LNaCl作为洗脱液,苯酚-硫酸法跟踪监测多糖液的出峰。收集分离所得多糖组分。将所得多糖组分分别用SephadexGl00凝胶柱继续纯化,水作为洗脱液。将样品继续上SephacrylS300凝胶柱纯化,得到高纯度多糖。采用SephacrylS300凝胶对纯化所得多糖组分进行纯度验证,出现单一对称峰,表示所得多糖组分为纯多糖。再结合比旋度法、紫外吸收光谱扫描验证多糖纯度。4.甘蔗滓多糖分子量及结构研究选用SephacylS-300凝胶柱层析测定多糖的分子量,通过已知分子量的标准葡聚糖T10、T40、T70、T500过Sephacyl S-300凝胶柱建立标准曲线,最终确定甘蔗滓多糖组分的分子量。通过对甘蔗滓多糖样品进行完全酸水解处理,采用高效离子色谱仪确定多糖的单糖组成。对多糖样品进行部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化分析等一系列化学处理,结合气相色谱、气质联用仪、红外光谱、核磁共振仪等分析仪器对多糖的结构单元进行分析。5.甘蔗滓粗多糖降脂护肝活性的研究通过饲喂高脂饲料,对大鼠进行高血脂症造模。将大鼠分为模型组、辛伐他汀组(10mg/kg)、甘蔗滓多糖高剂量组(900mg/kg)、甘蔗滓多糖中剂量组(600mg/kg)、甘蔗滓多糖低剂量组(300mg/kg)、正常对照组,每组10只动物。连续给药4周后,对其进行腹主动脉采血,检测总胆固醇(TC),甘油三脂(TG),高密度脂蛋白(HDL-C),低密度脂蛋白(LDL-C)水平。通过检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平,结合急性肝损伤病理切片评价甘蔗滓多糖护肝活性。研究结果:1.对甘蔗滓脱脂工艺研究结果表明,甘蔗滓多糖提取的最佳脱脂工艺为:乙醇和乙醚比例为:10%乙醇和90%乙醚;料液比为:1:25(g/mL),回流时间为4 h。通过对比Sevage法脱蛋白和酶法脱蛋白,最终确定Sevage法脱蛋白更适合。Sevage法进行8次脱蛋白时,蛋白损失率和多糖含量均达到最高。2.采用DEAE-52纤维素柱,对甘蔗滓多糖进行分离,得到2种甘蔗滓多糖组分:SRP1、SRP2。采用凝胶过滤法,用 SephadexGl00 凝胶、SephacrylS300 凝胶对所得的两种多糖组分(SRP1、SRP2)进行进一步分离纯化,结果显示两种凝胶对甘蔗滓多糖分离效果较好,得到单一对称峰。用SephacrylS300凝胶对两种多糖组分进行纯度验证,得到峰形为单一对称峰,说明多糖组分为纯多糖。用比旋度法、紫外吸收光谱扫描验证多糖纯度,未发现蛋白、核酸等杂质。苯酚-硫酸法检测SRP1、SRP2多糖含量分别为:93.2%、94.9%。3.用SephacylS-300凝胶柱层析测定多糖的分子量,多糖SRP1、SRP2分子量分别为:19340、75232。通过高效离子色谱分析单糖组成得出,多糖SRP1由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖组成,其摩尔比为9:5:15;多糖SRP2由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成,其摩尔比为8:10:9。通过一系列化学处理,结合各仪器分析结果可以推测出多糖的结构单元。多糖SRP1的结构单元由(→1)连接的Ara,(1→3)连接的Ara,(1→)连接的Gal,(1→3)连接的Gal,(1→3)连接的Man和(1 →3,6)连接的Man组成,比例为3:1:1:1:1:4。多糖SRP2的结构单元由(1 →)连接的Gal、(1→3)连接的Gal、(1 → 3)连接的Glc、(1→3)连接的Man、(1→3,6)连接的Glc组成,比例为2:1:1:3:2。4.降脂活性研究表明,模型组与正常组相比,体重明显减轻;血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇明显增加,高密度脂蛋白胆固醇及高总比明显降低;肝指数明显升高;肝细胞明显肿胀,说明造模成功。与模型组比较,甘蔗滓多糖具有降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C),提高高密度脂蛋白(HDL-C)的能力。说明甘蔗滓多糖具有降血脂作用,对高脂血症的发生有一定的预防作用。5.护肝活性研究表明,模型组与正常组相比,大鼠肝脂肪变性严重(P<0.01);与模型组比较,甘蔗滓各剂量组均有一定程度减轻大鼠肝脂肪变性的作用;甘蔗滓高剂量组具有降低血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量的作用;甘蔗滓高、中剂量组对CC14腹腔注射所致肝损伤有保护作用。说明甘蔗滓多糖具有良好的护肝作用。结论:1.甘蔗滓提取多糖过程中进行脱脂、脱蛋白等处理,能够提高多糖的提取率和多糖含量。采用水提醇沉法提取多糖,有低耗能、操作简单、适合工业生产等优点。2.选用DEAE-52纤维素、Sephadex G100凝胶、Sephacryl S300凝胶对甘蔗滓多糖进行分离纯化,能够达到良好的分离纯化效果,最终分离得到2种高纯度的多糖组分。对甘蔗滓多糖结构进行了分析,确定了其结构单元,为其进一步的新药开发奠定了基础。3.以大鼠作为动物模型的活性研究表明,甘蔗滓多糖具有良好的降脂护肝作用。对进一步利用开发甘蔗滓多糖具有指导意义。