前列腺癌在西方国家男性中是发病率居第一位而死亡率居第二位恶性肿瘤，在我国其发病率也在逐年升高。目前，对于早期的局限性的前列腺癌可以通过外科手术、放射治疗、化学治疗和冷冻治疗等方法进行治疗。而复发的疾病可以通过激素阻断的方法暂时控制疾病的进展。但是，几乎所有的前列腺癌病人会发展到对激素不依赖而导致疾病进展更快，对一些常规的治疗方法疗效较差。因此对这种前列腺癌的治疗，迫切需要新的更有效的治疗方法，如分子靶向治疗等。前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）是一种II型跨膜糖蛋白，其大小约为100 kD。它由3部分构成：短的胞内段，跨膜段和较长的胞外段。PSMA的表达与前列腺癌疾病的进展程度密切相关，在发生转移的前列腺癌和激素不依赖的前列腺癌PSMA的表达水平更高。而在其他正常组织，如肾脏、膀胱、肺脏、食管、肝脏、小肠的PSMA的表达水平均较低。而且PSMA在肿瘤相关的新生血管中表达也较高，而在和肿瘤无关的新生血管则不表达。基于以上几点，用针对PSMA的特异性抗体的免疫毒素对前列腺癌治疗是一种较好的方法。在哺乳动物细胞中，caspases家族成员参与了凋亡的主要调节信号。而在这个家族成员中，caspase-3起着更为重要的作用，它可以介导多种重要细胞蛋白的裂开而导致细胞凋亡。弗林蛋白酶作为一种内切蛋白酶也和细胞的分泌蛋白有很大的关系。弗林蛋白酶介导的免疫毒素的裂开对毒素发挥作用是重要的关键步骤。研究目的：本实验拟构建含有抗PSMA的单链抗体、弗林蛋白酶白喉毒素的酶切位点和反转的caspase-3的融合基因。并观察该融合基因对PSMA阳性表达前列腺癌细胞的杀伤作用，及表达该融合蛋白对PSMA阳性表达前列腺癌细胞的移植瘤抗瘤效果。研究方法：1.构建含有前导肽、抗PSMA的单链抗体（J591）、弗林蛋白酶白喉毒素的酶切位点（Fdt）和反转的caspase-3的融合基因，即pCMV-J591-Fdtrevcaspase3（Immunocasp-3）。并将该含有该融合基因的质粒采用脂质体转染到人CD4+淋巴瘤Jurkat细胞，并用G418筛选得到稳定表达该质粒的细胞克隆，命名为Jurkat-immunocasp-3。采用PCR、Western-blot等方法验证建系是否成功,及转染该融合基因对Jurkat细胞生长的影响。2.将该质粒采用脂质体转染的方法转染到PSMA阳性表达LNCaP细胞和PSMA阴性表达的PC-3细胞中，采用MTT和细胞计数的方法观察转染该质粒对两种前列腺癌细胞体外增殖情况的影响。转染Immunocasp-3和pCMV空载体后48h的LNCaP细胞用流式细胞仪观察细胞凋亡率，并透射电镜观察转染细胞的凋亡情况。并用transwell小室分别将PSMA阳性表达的LNCaP细胞、PSMA阴性表达的PC-3细胞和稳定转染的Jurkatimmunocasp-3细胞以1：3的比例共培养，并观察在不同时间内两种肿瘤细胞的存活情况。3.建立LNCaP的裸鼠皮下移植瘤模型，观察Immunocasp-3蛋白对移植瘤细胞的抗瘤效果。待荷瘤裸鼠移植瘤直径约5-7mm大小时，将其随机分为4组，每组5只。第一组采取肌肉注射脂质体包裹的Immunocasp-3质粒，10ug；第二组肌肉注射脂质体包裹的pCMV空载体，10ug；第三组尾静脉注射Immunocasp-3基因修饰的Jurkat细胞，2×106/个；第四组尾静脉注射未被基因修饰的Jurkat细胞，2×106/个。以上各组均为每3天注射一次，共注射6次。观察各组移植瘤裸鼠的肿瘤生长体积、裸鼠体重的变化，并观察裸鼠的生存时间。并用HE染色的方法观察尾静脉注射Immunocasp-3基因修饰的Jurkat细胞治疗组肿瘤和其它组织细胞的形态变化，并通过免疫组织化学染色的方法观察肿瘤组织及其它正常组织中caspase-3蛋白的表达。研究结果：1.成功的构建了pCMV-J591-Fdt-revcaspase 3质粒（Immunocasp-3），并经基因测序验证。成功建立了稳定表达该融合基因的Jurkat细胞。PCR结果显示在稳定转染的Jurkat细胞中有J591和revcaspase-3 mRNA的表达。稳定转染的Jurkat细胞的培养上清经浓集后亦可检测到caspase-3蛋白的表达。稳定转染和未转染的Jurkat细胞的生长曲线类似，表明转染该融合基因对Jurkat细胞的生长影响较小。2.将pCMV-J591-Fdt-revcaspase 3质粒分别转染到PSMA阳性表达LNCaP细胞和PSMA阴性表达的PC-3细胞中，结果发现转染该融合基因后明显抑制了LNCaP细胞的生长而对PC-3细胞的生长则无明显影响。转染后48小时的LNCaP细胞在透射电镜下可呈现出膜出泡、染色质固缩、凋亡小体形成等典型的凋亡细胞的特征,用流式细胞仪检测发现细胞的凋亡率为15.3%，明显高于转染pCMV空载体细胞凋亡率的5.5%。将PSMA阳性表达的LNCaP细胞、PSMA阴性表达的PC-3细胞和稳定转染的Jurkatimmunocasp-3细胞以1：3的比例共培养。发现稳定转染的Jurkat细胞分泌的Immunocasp-3蛋白可以杀死LNCaP细胞，而对PC-3细胞则影响较小。在共培养5天后，有约50%的LNCaP细胞被杀死。随着共培养时间的延长，其杀伤比例更高。3.通过使用不同的方法对LNCaP细胞的移植瘤治疗的实验发现，尾静脉注射Immunocasp-3基因修饰的Jurkat细胞和肌肉注射脂质体包裹的Immunocasp-3质粒均可显著的降低移植瘤的生长速度和明显延长荷瘤裸鼠的生存期。相比较于肌肉注射脂质体包裹的Immunocasp-3质粒的方法，尾静脉注射Immunocasp-3基因修饰的Jurkat细胞的方法疗效更好。对移植瘤裸鼠的肿瘤组织和其他组织进行免疫组化染色，结果显示，caspase-3蛋白只选择性地高分布于治疗组裸鼠的肿瘤组织中，在其他组织如心、肝、脾、肺、肾脏中则无表达。HE染色在其他正常组织中也未检测到形态异常的细胞。通过本实验研究发现，Immunocasp-3蛋白在体外和体内环境下均选择性的识别并导致PSMA阳性的前列腺癌细胞发生凋亡性死亡。另外，Immunocasp-3蛋白主要由人源化抗体和人体的自身蛋白构成，具有较低免疫源性。而且Immunocasp-3是通过引发肿瘤细胞发生凋亡而杀伤肿瘤细胞的，不会引起较强的炎症反应，治疗时的毒副作用相对较小。因此，本研究可望为PSMA阳性前列腺癌细胞的靶向性治疗提供一种新策略。