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黏附能力是益生菌发挥有益作用的先决条件，也是评价益生菌功能的重要指标之一，研究益生菌的黏附对认识微生态学的基本规律有着重要意义。益生菌对机体免疫系统的调节及作用机制也是目前研究的热点问题之一。本论文以牙鲆和大菱鲆为研究对象，探讨了益生菌对上述两种鱼类肠黏液的黏附特性，并从Toll样受体信号转导途径初步探讨了益生菌调节牙鲆免疫功能的分子机理。研究内容分为两部分，第一部分主要研究益生菌黏附特性，包括黏附检测方法的建立，高黏附性能菌株的筛选，表面黏附蛋白及肠黏液受体的鉴定及益生菌的肠道定植能力分析；第二部分主要研究高黏附能力益生菌(鼠李糖乳杆菌)通过Toll样受体介导的信号途径调节牙鲆机体免疫功能的分子机理。
1.MTT比色法测定微生物黏附能力的条件优化：对MTT比色法测定微生物数量的多种影响因素进行优化，以期建立稳定的反应体系，并以该方法测定微生物的黏附能力。试验比较了DMSO、HCl-Isopropanol、DMSO-SDS、DMF-SDS四种溶剂对甲躜颗粒(FMZ)的溶解效果以及在上述溶剂中FMZ的吸收光谱特性，分析了MTT与微生物作用时间对光吸收值的影响。最后利用优化的MTT比色法测定黏红酵母、鼠李糖乳杆菌及纳豆芽孢杆菌的活菌数量。结果，SDS-DMF溶剂对FMZ的溶解效果最好，在570nm波长有较大吸收值，MTT与微生物的孵育时间以2h为宜。在一定的浓度范围内，上述三种微生物的活菌数量与FMZ的OD值存在良好的线性关系。其中纳豆芽孢杆菌在6.30×106～2.02×108 cfu·ml-1范围内，活菌数量与FMZ的吸光度值呈良好相关性(R2=0.9981 )，鼠李糖乳杆菌和黏红酵母的线性范围分别为5.40×106～1.73x108 cfu·ml-1 (R2=0.9899 )、1.51×106～0.98×108cfu·ml-1 (R2=0.9921)。
2.不同益生菌株对牙鲆及大菱鲆肠黏液黏附能力的比较：采用MTT比色法测定鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黏红酵母和假丝酵母对牙鲆和大菱鲆肠黏液的黏附情况，获得对牙鲆和大菱鲆肠黏液具较强黏附能力的菌株，为后续的试验提供试验菌株。以碳烃化合物黏着法测定上述菌株的表面疏水性，以明确黏附能力与菌体表面疏水之间的相互关系。结果表明所有菌株均可黏附于牙鲆和大菱鲆肠黏液，黏附百分率在4％～25％之间。黏附能力由强到弱依次为：黏红酵母>鼠李糖乳杆菌>假丝酵母>嗜酸乳杆菌>枯草芽孢杆菌>纳豆芽孢杆菌。同一菌株对两种肠黏液的黏附能力无明显差别；但不同菌株对肠黏液的黏附能力则存在较大的差异。各菌株表面疏水性存在较大差异，其中黏红酵母表面疏水性最强；嗜酸乳杆菌疏水性最弱，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌及鼠李糖乳杆菌的表面疏水性处于中间水平。所测试的6株益生菌的表面疏水性与其黏液黏附能力之间无明显相关性。结论，黏红酵母和鼠李糖乳杆菌对牙鲆及大菱鲆肠黏液都具有较强黏附能力，这种黏附能力具有种属特异性，受宿主黏液影响较小。
3.黏红酵母黏附牙鲆肠黏液的影响因子研究：采用MTT比色法研究了pH、温度、二价阳离子对黏红酵母黏附作用的影响以及不同生长阶段的黏红酵母对牙鲆黏液的黏附特点。结果显示，在10～30℃黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附随温度升高而增强，中性偏酸的环境有利于黏红酵母的黏附；Ca2+能显著增加黏红酵母的黏附，但Mg2+促黏附作用不明显；处于对数生长期的黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附能力最强，其次是延滞期的酵母，而稳定期和衰亡期的黏红酵母黏附能力显著减弱。上述结果说明黏红酵母对牙鲆肠黏液的黏附作用不仅受多种环境因子的影响，也受其自身生理状态的影响，其黏附作用具有可控性，这对黏红酵母在牙鲆肠道内黏附、定植的调控有一定的参考价值。
4.黏红酵母和鼠李糖乳杆菌在牙鲆肠道的定植：将上述两种益生菌添加到基础饲料中连续投喂牙鲆21d，然后改投基础饲料继续饲养14 d(试验组)，对照组一直投喂基础饲料。分别于试验的第0、7、14、21、28、35d取样测定牙鲆肠道弧菌、乳酸菌及酵母数量，计算对照组与试验组牙鲆的成活率。结果表明，前21d试验组牙鲆肠道黏红酵母数量达到了104 cfu·g-1，乳酸菌数量达到106cfu·g-1，显著高于对照组；试验组牙鲆肠道弧菌总数随黏红酵母及鼠李糖乳杆菌的增加而减少，并显著低于对照组。改投基础饲料后，试验组牙鲆肠道两种益生菌在肠道中的数量明显减少，但仍高于对照组；弧菌总数有所增加，但显著低于对照组。试验组牙鲆成活率高于对照组。结论：黏红酵母和鼠李糖乳杆菌能够在牙鲆肠道定植，并能降低牙鲆肠道弧菌总数，降低牙鲆死亡率。因此具有较好的应用前景。
5.黏红酵母表面黏附相关蛋白及黏液受体的初步研究：前期的试验发现黏红酵母对大菱鲆肠黏液具有较强黏附能力，为进一步了解其黏附机制。采用Western-blot技术，对黏红酵母表面黏附蛋白和肠黏液受体进行了初步研究。结果表明，黏红酵母表面蛋白预先与肠黏液孵育2h后，显著抑制了黏红酵母与肠黏液的结合，其黏附百分率下降了83.6％；Western-blot显示黏红酵母表面蛋白中分子量为38.5 ku和28.6 ku的两个蛋白参与对肠黏液的黏附过程，大菱鲆肠黏液中分子量为27.3 ku和22.3 ku两个蛋白可与黏红酵母表面蛋白特异性结合。糖原染色显示上述四个蛋白均为糖蛋白。
6.鼠李糖乳杆菌通过Toll样受体信号途径诱导牙鲆天然免疫反应：为阐明Toll样受体信号途径在鼠李糖乳杆菌诱导牙鲆天然免疫反应中的作用，将鼠李糖乳杆菌和牙鲆巨噬细胞共同培养2h，然后用半定量反转录PCR法分析巨噬细胞Toll样受体(TLR2、TLR22)及肿瘤坏死因子(TNF-α) mRNA的表达情况，用凝胶阻滞电泳测定核转录因子NF-κB的活化状态。结果表明巨噬细胞经鼠李糖乳杆菌刺激后TLR22，TLR2及TNF-α mRNA表达量显著增加，凝胶阻滞试验也证实鼠李糖乳杆菌刺激后巨噬细胞核转录因子NF-κB被激活。为进一步评价胞外信号调节酶(ERK)，p38MAPK及核转录因子NF-κB在鼠李糖乳杆菌诱导巨噬细胞TLR2、TLR22和TNF-α mRNA表达中的作用，巨噬细胞先用ERK、p38MAPK及NF-κB特异性抑制剂PD98058，SB203508和BAY11-7082分别预处理1h，然后再与鼠李糖乳杆菌共培养2h。结果显示p38MAPK抑制剂SB203580预处理巨噬细胞1h后，显著抑制了巨噬细胞TLR22,TLR2及TNF-α mRNA的表达。抑制核转录因子NF-κB也显著降低了TNF-α的表达，但是不能抑制巨噬细胞TLR22、TLR2 mRNA的表达。综上所述，鼠李糖乳杆菌可能通过TLR22、TLR2介导的信号途径诱导TNF-α mRNA的表达，从而起始牙鲆天然免疫反应，而p38MAPK信号途径参与了巨噬细胞TLR22，TLR2及TNF-α基因的表达调控。