论文部分内容阅读
目的:本文目的是探究整合素连接激酶（ILK）基因对食管鳞癌（ESCC）细胞的顺铂（CDDP）化疗敏感性的影响及其潜在机制,以期为提高ESCC化疗疗效提供理论及实验基础。方法:1)通过TCGA数据库分析ILK在ESCC患者中的表达及预后相关性;收集新鲜ESCC组织及其癌旁组织,RT-q PCR、Western blot探究ILK基因在其中的表达是否具有差异。免疫组化（IHC）检测组织芯片中ILK基因在ESCC组织及对应的癌旁组织中的表达差异,分析ILK表达与临床病理特征的相关性;同时检测组织芯片中Wnt信号通路关键蛋白β-catenin的表达情况,并分析其与ILK表达的相关性;2)RT-q PCR和Western blot检测5种人ESCC细胞株（EC109、EC9706、KYSE150、KYSE30和TE-1）和食管上皮细胞系SHEE细胞中ILK表达情况。在目标ESCC细胞系中过表达或沉默ILK,采用CCK8增殖实验,克隆形成实验,流式细胞实验,Transwell实验等检测ILK表达对ESCC细胞生物学行为以及对ESCC细胞对CDDP敏感性的影响。RT-q PCR和Western blot检测ILK过表达及干扰后,细胞增殖,凋亡以及侵袭转移相关分子:PCNA、Ki67、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、Bcl-2、MMP9、MMP2和Cox2 m RNA或蛋白的表达;Western blot检测ILK沉默后,细胞中GSK3β磷酸化水平、Wnt信号通路关键蛋白β-catenin、通路下游靶基因c-MYC,Cyclin D1及耐药相关蛋白MDR1的表达。荧光素酶报告基因实验检测ILK沉默对Wnt信号通路活性的影响。并设计挽救实验,探究β-catenin过表达对ILK基因沉默后,ESCC细胞对CDDP敏感性的变化,验证ILK对ESCC化疗敏感性的影响与Wnt/β-catenin的关系;3)建立ILK基因过表达或沉默稳转ESCC细胞株,然后将转染ESCC细胞经皮下接种裸鼠,以此构建小鼠皮下成瘤模型,予以CDDP或PBS腹腔灌注。观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。采用IHC和TUNEL法检测移植瘤中细胞增殖、细胞凋亡以及β-catenin表达情况。结果:第一部分:生信分析显示ILK在ESCC组织中高表达,并且和患者预后相关;RT-q PCR和Western blot结果显示ILK基因在ESCC组织中m RNA和蛋白表达水平均高于癌旁组织。同时,IHC结果分析显示:80例癌组织中,除去2例缺失组织,78例ESCC组织纳入研究,其中62例高表达ILK,阳性率79.5%;癌旁组织中共有74例组织纳入研究,其中6例高表达ILK,阳性率8.1%,差异有统计学意义;ESCC组织中ILK基因的高表达与淋巴结转移及肿瘤分化程度有关（P＜0.05）;此外,ESCC组织中ILK的表达与β-catenin核/浆表达显著正相关。第二部分:ILK基因过表达能够显著增强ESCC细胞的增殖、侵袭及迁移能力,并明显降低ESCC细胞的凋亡水平,下调Bax,Cleaved-caspase-3和Cleaved-caspase-9的表达,同时上调Bcl-2、MMP9、MMP2和Cox2的表达;ILK基因过表达可降低ESCC细胞对CDDP的敏感性,而ILK沉默则具有相反的作用;在ESCC细胞中沉默ILK可降低GSK3β的磷酸化水平、抑制β-catenin表达和Wnt信号通路的激活,以及c-MYC、Cyclin D1和MDR1的表达;此外,β-catenin过表达可在一定程度上拮抗ILK沉默所促进的ESCC细胞对CDDP的敏感性。第三部分:相比于对照组,ILK过表达可削弱CDDP对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,降低瘤体组织中细胞凋亡的水平,并可显著增加CDDP处理组中β-catenin表达水平;而ILK沉默则可进一步增强CDDP对裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,提高CDDP处理组瘤体中细胞凋亡水平,同时抑制瘤体中β-catenin的表达。结论:ILK在ESCC组织中高表达,与β-catenin核/浆表达显著正相关,且与肿瘤分化程度及淋巴结转移明显相关。ILK基因过表达可显著增强KYSE-150和TE-1细胞增殖、迁移以及侵袭的能力,减少KYSE-150和TE-1细胞凋亡,ILK基因沉默则具有相反的作用;ILK基因的沉默会降低胞内GS3Kβ的磷酸化水平,抑制β-catenin和Wnt信号通路活性及耐药相关蛋白MDR1的表达,增强ESCC细胞CDDP敏感性,过表达ILK则会降低ESCC细胞CDDP敏感性,其机制可能是ILK通过磷酸化GS3Kβ,影响β-catenin的表达水平进而影响Wnt信号通路活性引起的;裸鼠成瘤实验结果显示,ILK过表达可以削弱体内ESCC细胞对CDDP敏感性,沉默ILK则可以增强体内ESCC细胞对CDDP敏感性。为ESCC的治疗提供了一种新的策略。