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β-1,3-葡聚糖酶是一类能够水解以β-1,3-糖苷键连接的葡聚糖的酶系,广泛分布于真菌、植物、细菌和无脊椎动物中。β-1,3-葡聚糖酶是重要的细胞壁水解酶,可以降解真菌的细胞壁,在真菌病害防治中发挥重要作用,因此成为抗真菌基因工程的研究热点之一。昆虫和细菌β-1,3-葡聚糖酶属于GH16家族,目前对其功能和抗真菌活性的相关研究还不充分。因此,本论文以亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶和环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶为对象,分析其酶学性质和生物活性,期望为靶向真菌细胞壁的生物防治策略提供新的酶源。本论文包括以下研究工作:(1)获得了亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶的cDNA序列OfLam,该cDNA的CDS长度为1128 bp,可编码氨基酸长度为375 AA,理论分子量为42.2 kD,等电点p I=5.16。进化分析表明,OfLam与昆虫源β-1,3-葡聚糖酶的亲缘关系最近,具有GH16家族特征性的保守催化基序;实时荧光定量PCR实验表明,亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶在其中肠中表达水平远高于其他组织,且在幼虫时期的表达量远高于卵期、蛹期和成虫期。(2)构建了pET28a-OfLam表达载体,获得了亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶Of Lam,采用金属螯合层析,在250 mM咪唑溶液中获得目的蛋白,产量为2.5 mg/L。SDS-PAGE结果显示,重组Of Lam的实际分子量约为30 kD,比理论值小,具有β-1,3-葡聚糖酶活性;生化性质表征的结果显示,亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶OfLam对底物昆布多糖的最适pH为4.5,最适反应温度为50℃;其Km值为1.59±0.28 mg/mL,kcat值为15.8±0.66 s-1;重组Of Lam具有广泛的底物谱,并可以水解真菌细胞壁。(3)实现了环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶BcLam的重组表达,采用金属螯合层析,在250 mM咪唑溶液中获得目的蛋白,产量为50 mg/L。据SDS-PAGE和质谱鉴定,重组BcLam的实际分子量为43.29 kD;生化性质表征的结果显示,环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶BcLam对底物昆布多糖的最适pH为6.0,最适反应温度为50℃,与其他来源的β-1,3-葡聚糖酶相比,BcLam具有宽泛的底物谱和最高的水解活性。在真菌细胞壁降解实验中,结合预处理手段,BcLam表现出优于商品化酶的高活性,且BcLam与烟曲霉几丁质酶B按摩尔浓度1:1,水解效率增加。在抑制尖孢镰孢菌孢子生长的实验中,BcLam与AfChiB也具有协同效应,其中BcLam发挥主要作用。(4)对Bc Lam的结晶条件进行了初筛,在2个目标蛋白浓度共400个筛选条件中确定3个初步结晶条件,将进行下一步优化。