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研究目的：1.构建肌切蛋白(Scinderin, SCIN)基因shRNA慢病毒载体及SCIN基因过表达载体2.探讨SCIN基因在结直肠癌组织中的表达与肝转移的关系。3.寻找抗肿瘤治疗的新靶点。研究方法：1.利用基因芯片杂交技术筛选结直肠癌肝转移组与无转移组中差异表达的基因,并用荧光定量PCR技术验证具有显著差异表达的基因。基因芯片和RT-PCR试验结果均显示SCIN基因是其中较显著差异表达的基因。2.筛选出针对SCIN基因4条理论上最佳的siRNA序列,siRNA序列合成shRNA框架DNA片断后,两端含酶切位点粘端,可以直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,在进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的SCIN基因RNA干扰慢病毒载体。3.从含有SCIN基因的质粒或cDNA文库中,利用PCR方法钓取SCIN基因,将SCIN基因与目的载体分别进行酶切。酶切产物电泳回收后进行定向连接或者交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的SCIN基因过表达载体构建4.将各个靶点慢病毒颗粒以优化的条件感染培养的目的细胞,48∽72h后采用Real-time PCR和western-blot两种实验方法,同时在mRNA水平和蛋白水平检测SCIN基因的敲减(Knock Down)效率,选择mRNA水平对基因沉默>70%的靶点为有效靶点。5.将有效靶点的穿梭载体平行包装多盘病毒,收获的病毒上清进行纯化、浓缩,并测定病毒滴度,得到高滴度的慢病毒颗粒大量感染细胞,培养之后进行后续功能实验。6.将包装好的慢病毒感染人结肠癌SW480和DLD-1细胞,qPCR和Western blot结果显示SCIN敲降后两种细胞中SCIN的表达得到明显抑制。选取上述两株细胞进行MTT和Transwell功能实验。结果：1. VshRNA片段与载体连接后,转化大肠杆菌,每个片段均挑取5个克隆进行PCR鉴定,连接入vshRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为343bp(从载体中切掉24bp)；没有连接入vshRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为306bp,连接入载体的vshRNA基因片段大小为79bp,与设计的干扰序列长度一致。2.4对不同序列的siRNA-SCIN基因慢病毒表达载体DNA测序结果证实：PSCSI1762-1,PSCSI1762-2, PSCSI1763, PSCSI1764, PSCSI1765载体均有一段与SCIN基因siRNA模板核苷酸相同,说明我们已经将合成的双链DNAoligo插入到vshRNA载体中,成功构建了RNA干扰慢病毒载体。3.PCR获得SCIN基因片段,PCR产物酶切后大小：1412bp。PCR扩增SCIN功能基因片段及酶切后电泳条带片段大小与理论值一致,认为获得了SCIN基因片段。PCR酶切产物与酶切真核表达载体连接,转化大肠杆菌后,PCR产物大小740bp。获得的阳性克隆送测序,重组的SCIN基因过表达载体测序与目标基因序列完全一致,说明我们已将合成的SCIN基因插入到真核表达载体中,成功构建了SCIN基因过表达载体。4.从Western Blot结果可以看出,KD3 siRNA靶点对SCIN基因的表达有显著的敲减作用,因而是有效靶点,其靶序列为CCGGCACGAGATGAGCTGAC AACATTTCAAGAGAATGTTGTCAGCTCATCTCGTGTTTTTG。选择该靶点shRNA载体进行慢病毒包装。病毒滴度达2×109TU/mL。5.MTT法检测结肠癌细胞SW480和DLD-1两株细胞的生长情况结果显示,siRNA-SCIN干扰组SW480和DLD-1两株细胞的增殖明显受抑制,活细胞数量下降,到第5d与阴性对照组NC比较OD值显著降低,两组差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。6. Transwell侵袭实验检测结直肠癌细胞SW480和DLD-1两株细胞的侵袭能力,结果显示DLD-1细胞株经Transwell小室培养模型培养后穿过聚碳酸酯膜的细胞数,siRNA-SCIN干扰组较NC组明显减少,侵袭率显著低于NC组(P<0.05)。穿过聚碳酸酯膜的SW480细胞株情况与DLD-1细胞株相似,siRNA-SCIN干扰组较NC组侵袭率显著降低(P<0.05)。结论：本研究得出以下结论：1)本组实验成功的构建shRNA慢病毒载体及SCIN基因过表达载体；2)本研究结果提示SCIN基因在结直肠癌组织中的表达上调与肝转移相关；3)可能机制：SCIN基因在结直肠癌组织中的表达上调,导致丝状肌动蛋白(F-actin)解聚,丝状肌动蛋白解聚导致细胞骨架改变,进一步导致结直肠癌肝转移的发生。4)SCIN基因将来可作为预测结直肠癌肝转移的指标,亦可作为抗肿瘤治疗的新靶点。