论文部分内容阅读
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是黄病毒科黄病毒属成员,为单正链RNA病毒。病毒基因组编码单一开放阅读框,其蛋白多肽前体经切割形成结构蛋白与非结构蛋白。且非结构蛋白于内质网形成复制复合体,为HCV复制提供场所。HCV极易形成持续性感染,是威胁人类健康的重要病原体。已有文献报道HCV感染细胞后,可使细胞产生应激颗粒。应激颗粒(Stress Granule, SG)是细胞在接受包括氧化物,病毒感染等一定程度的外界刺激后而产生的致密颗粒状聚合体,由真核翻译起始复合物,RNA结合蛋白以及停止翻译的mRNA等成分组装成,是细胞应激状态下重要的调节元件。到目前为止,HCV诱生细胞应激颗粒的机制未明,且应激颗粒对HCV持续性感染是否存在影响未知,本研究拟探讨HCV对细胞应激颗粒是否存在调节作用,并应激颗粒的产生对HCV形成持续性感染是否发挥作用。本研究首先对HCV感染诱生的应激颗粒的组成及性质进行了研究。利用免疫荧光染色,明确了HCV (JC1)感染Huh7细胞后所形成的应急颗粒包含四种应激颗粒关键成分,即翻译相关蛋白eIF4G,eIF3A以及RNA结合蛋白G3BP1,TIA-1,故为完整的应激颗粒。同时发现,HCV感染Huh7细胞诱生的应激颗粒能够被氧应激型应激颗粒抑制剂放线菌酮(CHX)有效抑制,确认HCV诱生的应激颗粒典型应激颗粒。在确认HCV能够诱生典型应激颗粒的基础上,发现HCV感染Huh7细胞后8小时应激颗粒阳性细胞的比例为3%：12小时内,应激颗粒阳性细胞比例上升至8%,在24小时达到峰值13.4%,48小时后回落至10%,72小时又升至13%左右,则表明HCV感染诱生的低水平应激颗粒,并存在波动。同时观察到,相较于包括SFV、MHV等病毒在内的多种RNA病毒在感染早期能够使35%以上的被感染细胞产生应激颗粒,HCV在早期感染建立(即0-12小时内)时期仅诱生少量应激颗粒(约8%)。进而研究发现在应激颗粒诱导剂(亚砷酸钠,NaAsO2)的刺激下,Huh7细胞感染HCVcc病毒8小时与不感染相比,诱生应激颗粒阳性细胞比例显著下调了42%,提示HCV在感染早期具备抑制细胞诱生应激颗粒的能力。以往研究表明病毒蛋白或核酸具备抑制应激颗粒形成能力,推测HCV早期感染翻译出的病毒蛋白有可能通过某种机制抑制应激颗粒形成。于是进一步探讨HCV五种主要病毒蛋白(core、NS3/4A、NS4B, NS5A、NS5B等)对细胞应激颗粒诱生水平的影响,发现在过表达的情况下,仅HCV RNA多聚酶NS5B能够抑制亚砷酸钠诱导产生的应激颗粒(降低约40%),并呈剂量依赖关系。同时还发现,在表达NS5B并未能诱生应激颗粒的细胞中,应激颗粒组成分子G3BP1与NS5B呈部分共定位。同时NS5B的抑制功能及与G3BP1的共定位在HepaG2源的tet-on-NS5B诱导表达细胞系统中得以验证(降低约42%)。进一步实验证实,NS5B过表达不影响亚砷酸钠诱导PKR激活以及e IF2α磷酸化的水平,表明NS5B抑制应激颗粒的形成发生在e IF2α磷酸化的下游,即应激颗粒装配期,提示NS5B的抑制作用靶点为应激颗粒组成成分。综上所述,NS5B抑制应激颗粒可能发生在装配期,并与G3BP1共定位,同时本室前期曾报道G3BP1与NS5B存在相互作,提示NS5B可能通过直接与G3BP1相互作用以抑制应激颗粒。为进一步确证NS5B是如何通过与G3BP1相互作用干扰应激颗粒形成,首先明确NS5B负责结合G3BP1的作用区段。构建了G3BP1-GST融合蛋白以及NS5B三段主要截短突变体,利用GST pull-down实验确认了NS5B中间手掌结构段(96-454aa)负责与G3BP相互作用；进而在Huh7细胞过表达NS5B全长及其三段截短体,并用诱导剂诱生应激颗粒,发现仅过表达G3BP1的结合区段(NS5B,96-454aa)与NS5B全长能够抑制应激颗粒的产生(NS5B,96-454aa下降35%；NS5B全长下降38%)。上述实验结果表明,NS5B通过其中间手掌结构段(96-454aa)与G3BP1相互作用而干扰应激颗粒的形成。研究表明在持续刺激下,应激颗粒中的细胞mRNA会进入降解途径使细胞受损,同时有报道发现HCV诱生的应激颗粒中大量包含有ISG基因mRNA而导致ISG蛋白表达水平下降,推测NS5B影响G3BP1抑制应激颗粒的生理学意义可能存在两种解释：一方面防止过量诱生应激颗粒造成细胞必需蛋白供应不足而受损以致影响感染建立,另一方面则通过上调干扰素刺激基因(ISG)的表达以帮助病毒维持低水平复制从而导致慢性化。实验结果显示NS5B不影响应激颗粒对管家基因β-actin的翻译抑制。进一步通过过表达NS5B,干扰素及刺激剂处理等条件模拟HCV感染后病毒蛋白表达,诱生干扰素刺激基因(ISG)蛋白表达与应激颗粒的情况。结果发现NS5B全长及手掌结构段分别显著上调应激颗粒对ISG分子ISG20, APOBEC3G翻译抑制(全长：ISG20,上调141%；APOBEC3G,上调172%.手掌结构段：ISG20,上调112%；APOBEC3G,上调134%)。综上所述,本研究发现HCV RNA多聚酶NS5B通过其手掌结构(96-454aa)与应激颗粒关键组成蛋白G3BP1相互作用,干扰G3BP1参与细胞应激颗粒的装配,从而抑制HCV感染早期的12小时内细胞应激颗粒的形成。这一结果提示HCV可能通过NS5B抑制应激颗粒,回复某些干扰素刺激基因编码蛋白的表达,以负反馈途径维持HCV低水平感染,这对于HCV持续性感染提供了一种可能的解释,为进一步深入研究阐HCV与宿主细胞间关系提供了一定提示。