腺联病毒(AAV)载体在基因治疗、疫苗研发等方面具有广阔的应用前景,但其应用受到规模化制备和现有纯化工艺的制约。病毒受体结合捕捉是将病毒受体结合的特异性与磁珠分离技术的有效性相结合,已成功用于环境样品的病毒浓缩与监测,但磁珠分离需要较昂贵的仪器和配套试剂。类弹性蛋白多肽(ELP)具有温度敏感的可逆相变特性,其融合蛋白可用简单的相变循环(ITC)纯化。AAV受体(AAVR)含5个多囊肾病结构域(PKD),其中PKD1是AAV5的结合部位,PKD2是AAV2的结合部位,其它血清型AAV结合需要PKD1和PKD2的共同参与。本研究将AAVR的PKD与ELP进行融合表达,利用相变循环纯化融合蛋白,旨在建立简单、经济的重组AAV浓缩与纯化方法。将AAVR的PKD1和PKD2基因片段插入ELP融合表达载体,将重组载体pELP-PKD转化BL21(DE3)大肠杆菌,用0.2mM IPTG在20℃诱导融合蛋白表达;对ELP-PKD融合蛋白的相变温度和盐浓度进行优化,在优化条件下进行ITC;利用SDS-PAGE和免疫转印法分析纯化蛋白的纯度、产量和表达正确性。结果显示重组大肠杆菌表达预期的73ku ELP-PKD融合蛋白,最佳相变温度为26℃,相变循环所需的氯化钠浓度为2M,纯化的融合蛋白纯度达92%。用本课题组构建的pBacFast-RC和pBacFast-GFP转染昆虫细胞,用获得的重组杆状病毒rBac-RC和rBac-GFP感染昆虫细胞,将获得的重组病毒AAV-GFP与ELP-PKD融合蛋白混合,用ITC沉淀蛋白-病毒复合物,用试剂盒抽提的病毒DNA进行PCR扩增。分别对ELP-PKD融合蛋白结合AAV-GFP的蛋白浓度、温度、pH和时间进行优化,并对AAV-GFP的洗脱pH、温度和时间进行优化。结果显示ELP-PKD融合蛋白能特异性结合AAV-GFP,最佳蛋白浓度为100 μg/mL,最佳结合温度为4℃,最佳结合pH为7.0,最佳结合时间为15min。洗脱AAV-GFP的最佳pH为3.0,最佳温度为25℃,最佳时间为30min。纯化AAV-GFP具有AAV的典型形态,能感染猪肾PK-15细胞,VP1、VP2、VP3结构蛋白比例约为1:1:10。用rBac-RC和rBac-GFP共感染昆虫细胞,用pAAV-RC和pAAV-GFP共转染AAV-293细胞,用ELP-PKD结合捕捉细胞裂解液中的AAV-GFP,洗脱前后在AAV-293细胞上进行病毒滴定。结果显示ELP-PKD从AAV-293细胞纯化AAV-GFP的回收率为44%,从昆虫细胞纯化AAV-GFP的回收率为47%,纯化过程仅需1.6h。