目的（1）通过表达外源性Wnt5a基因的Ad5-Wnt5a-GFP载体转染bMSCs，获得高表达Wnt5a蛋白的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymalstem cells bMSCs）；以HL60细胞作为实验细胞，研究外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs对HL60细胞增殖抑制，诱导分化作用，并初步探讨Wnt5a对HL60细胞作用的相关分子机制；（2）通过建立外源性Wnt5a修饰的bMSCs的SCID白血病小鼠模型，研究外源性Wnt5a在SCID白血病小鼠骨髓细胞的持续功能性表达水平及表达时限，进一步探讨在化疗过程中,外源性Wnt5a基因对SCID白血病小鼠体内骨髓保护以及肿瘤抑制的作用。方法（1）以乒乓交互感染法，人胚肾细胞株HEK293细胞为包装细胞，扩增Ad5-Wnt5a-GFP浓缩病毒上清,测定病毒滴度；通过密度梯度离心和差速贴壁培养的方法从正常人骨髓分离培养获得bMSCs；光学显微镜观察bMSCs的体外生长形态特性，FCM检测bMSCs的细胞表面标志物CD34，CD44，CD45的表达水平，茜素红染色和ALP活性法检测bMSCs的多向分化潜能;（2）倒置荧光显微镜观察转染后的bMSCs绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，FCM检测Ad5-Wnt5a-GFP对bMSCs的转染效率，筛选最适感染复数（MOI），RT-PCR技术和ELISA实验分别从基因表达水平和蛋白表达水平，检测外源性Wnt5a基因在人bMSCs的表达情况，细胞计数法检测各组bMSCs的存活状态及增殖情况；（3）通过外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs与HL60细胞共培养的方法，检测Wnt5a对HL60细胞生长抑制和诱导分化的作用。实验分组：A实验组：HL60/Ad5-Wnt5a-GFP/bMSCs细胞组; B空载体对照组：HL60/Ad5-GFP/bMSCs细胞组；C空白对照组1: HL60/bMSCs细胞组; D空白对照组2：HL60细胞组；FCM检测各组HL60细胞的周期变化，MTT法检测各组HL60细胞的增殖水平，瑞氏染色观察各组HL60细胞的形态变化；免疫细胞化学染色（IHC）法检测各实验组HL60细胞表面分化抗原CD13、CD14、CD68的变化；（4） RT-PCR、免疫荧光（IF）、Western Blot技术分别从分子水平和蛋白水平，检测共培养后各组HL60细胞表面受体ROR2，FZD5，Wnt信号转导蛋白β-Catenin、靶基因CaMKⅡ、cyclinD1的表达情况；（5）SCID小鼠通过⁶⁰Co全身照射，总剂量为2.0Gy，预处理后24小时内，尾静脉接种HL60细胞，建立SCID小鼠人白血病模型；记录SCID小鼠的生存时间和发病情况，瑞氏染色镜下观察SCID小鼠外周血白细胞和瘤细胞的形态和数量改变； FCM检测SCID小鼠骨髓细胞CD33阳性表达率的变化，HE染色及FCM检测SCID小鼠肝、脾、肺、肾组织白血病细胞浸润情况；（6）SCID白血病小鼠建模24h后，尾静脉注射外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs，移植两次，每次间隔24小时，建立外源性Wnt5a修饰的bMSCs的荷瘤鼠移植模型。实验分组：A实验组： Ad5-Wnt5a/SCID白血病模型小鼠；B空载体对照组：Ad5-GFP/bMSCs/SCID白血病模型小鼠；C空白对照组1：bMSCs/SCID白血病模型小鼠；D空白对照组2：SCID白血病模型小鼠；RT-PCR和Western Blot检测各组SCID白血病小鼠骨髓细胞外源性Wnt5a基因mRNA和蛋白表达情况；（7）建立外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs的SCID白血病小鼠移植模型第21天后，予Ara-c连续7天皮下注射；实验分组同方法6。统计各组SCID白血病小鼠的体重，生存时间和存活率；化疗结束后一周，血球分析仪计数各组SCID白血病小鼠外周血白细胞，红细胞，以及血小板的数量；甲基纤维素半固体集落培养法检测各组SCID白血病小鼠骨髓造血细胞集落形成能力; FCM和IHC技术检测化疗后各组SCID白血病模型小鼠骨髓和外周血CD33阳性细胞数，HE染色观察各组SCID白血病小鼠肝、脾、肺、肾脏器病理改变和肿瘤细胞浸润情况。结果（1）收获重组腺病毒液感染滴度达4.7×10⁹（PFU）/mL；倒置显微镜下观察原代bMSCs呈长梭形，集落方式生长，传代后不再以集落方式生长，呈均匀分布生长；bMSCs表面的特异性分化抗原标记物CD44的阳性表达率为97.77％，CD34,CD45阳性表达率分别为1.07%和0.10%；bMSCs诱导成骨后，细胞茜素红染色和ALP活性检测，诱导组与未诱导组相比，茜素红染色阳性明显增强，ALP活性明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）；（2）外源性Wnt5a基因成功转染bMSCs，当MOI=100以及转染时间为72h时,细胞的生长状态最好，细胞活力保持在80%以上，平均转染率稳定在38.68%；从基因表达和蛋白表达水平上，证实外源性Wnt5a在bMSCs中能够持续高表达；bMSCs在外源性Wnt5a基因修饰后第4天至第7天，细胞计数与其他两对照组相比显著升高（P<0.05）；（3） MTT检测HL60细胞增殖结果显示，实验组HL60细胞数量与其他三个对照组相比，显著降低（P<0.05）；实验组HL60细胞与其他三组对照组相比，增殖活跃期细胞减少，细胞周期阻滞在G2期，差异有统计学意义（P<0.05）；瑞氏染色光镜下观察实验组HL60细胞，其他三组对照组相比，细胞体积缩小，核浆比减小，可见核凹陷；各组HL60细胞表面粒细胞系标志抗原CD13表达水平无显著性差异（P>0.05），实验组HL60细胞单核细胞系表面标志抗原CD14，CD68表达水平与其他三组对照组相比，显著升高（P<0.05）;（4）实验组HL60细胞中ROR2和CaMKⅡ的mRNA及蛋白表达水平与其他三组对照组相比，明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），三对照组间HL60细胞中ROR2和CaMKⅡ的mRNA及蛋白表达水平无显著性差异（P>0.05）;各组HL60细胞中FZD5的mRNA及蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）；实验组HL60细胞中β-catenin和cyclinD1的mRNA及蛋白表达水平与其他三组对照组相比，显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；（5）成功建立白血病小鼠模型，成瘤率达到100％，自然病程30-42天，小鼠在腹部和臀部可形成实体瘤块，肝脾肿大，SCID小鼠接种3周后外周血白细胞数与接种前比较显著升高（P<0.01）； SCID小鼠接种HL60细胞后骨髓细胞CD33细胞阳性率与接种前比较，明显升高（P<0.01），小鼠骨髓，肝、肺、脾、肾脏器中可见到CD33表达阳性的白血病细胞，与接种前SCID小鼠相比表达明显升高（P<0.01）；（6）实验组SCID白血病小鼠骨髓细胞Wnt5a mRNA和蛋白表达水平与三个对照组相比，显著增高（P<0.01），三个对照组SCID白血病小鼠骨髓细胞表达Wnt5a mRNA和蛋白量很少，组间表达差异无统计学意义（P>0.05）；实验组SCID白血病小鼠骨髓细胞Wnt5a基因和蛋白表达水平在移植后第2到4周明显高表达，与第1周和第5周相比，差异有统计学意义（P<0.05），第2,3,4周之间的Wnt5a mRNA和蛋白的表达水平无明显差异（P>0.05）；（7）在化疗过程中，各组SCID小鼠活动度减少，体重均有不同程度减轻，实验组SCID小鼠的体重在化疗结束时和结束后一周，均比对照组小鼠重（P<0.05）；实验组SCID白血病小鼠存活率明显高于与其余三组SCID白血病小鼠（P<0.05），化疗结束后一周实验组SCID白血病小鼠外周白细胞计数明显比对照组高（P<0.05），甲基纤维素半固体集落培养法检测结果提示实验组白血病小鼠骨髓细胞集落形成能力明显高于三对照组（P<0.05）；实验组SCID白血病小鼠外周血和骨髓CD33阳性细胞数明显低于三对照组（P<0.05），三个对照组SCID小鼠外周血和骨髓CD33阳性细胞数无显著性差异（P>0.05）；各组SCID小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏病理切片染色后观察，均未见到白血病细胞浸润，三对照组SCID小鼠可见肝脏细胞水肿，肺脏和肾脏不同程度的出血，实验组SCID小鼠脏器未见出血灶。结论（1）在体外成功获得高纯度的人bMSCs，建立了外源性Wnt5a基因稳定转染bMSCs的体系，获得外源性Wnt5a基因高效表达的bMSCs；（2）外源性Wnt5a在bMSCs中能够稳定有效高表达，并且能够促进bMSCs的体外增殖；（3）外源性Wnt5a能抑制HL60细胞增殖，将细胞周期阻滞在G2期,诱导HL60细胞向成熟单核细胞方向分化；（4）Wnt5a对HL60细胞作用可能的分子机制：外源性Wnt5a与细胞表面受体ROR2结合，使细胞内钙释放，激活HL60细胞中Wnt5a／Ca²⁺信号传导途径，促使CaMKⅡ表达上调，抑制Wnt经典信号途径，β-catenin的表达受到抑制，HL60细胞cyclin D1表达下调，从而导致HL60细胞增殖受到抑制，向成熟方向分化。外源性Wnt5a在HL60细胞中可能作为肿瘤抑制因子发挥作用；（5）成功建立人白血病（HL60）SCID小鼠模型和外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs移植的SCID白血病小鼠模型，建模成功率100%；真实再现人白血病累及骨髓，全身弥漫性浸润特点，白血病小鼠自然病程30-42天；（6）从基因和蛋白水平上，证实了外源性Wnt5a基因修饰的bMSCs能够定植在SCID白血病小鼠骨髓，在移植后第2周开始出现高表达，第4周达到高峰，第5周表达下降，为进一步实验提供可靠的依据和保障；（7）SCID白血病小鼠化疗过程中，定植于SCID白血病小鼠骨髓的外源性Wnt5a基因，适时发挥了抑制白血病细胞生长和支持骨髓造血的作用，明显提高了化疗中白血病小鼠的存活率，让化疗收到更好的疗效；（8）本实验提示外源性Wnt5a在白血病小鼠体内可能作为造血支持因子和肿瘤抑制因子发挥作用。