长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度大于200nt，自身不编码为蛋白的非编码RNA。目前研究表明，lncRNA可以在多种层面上调控基因的表达水平[1-2]。它参与了基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输以及X染色体沉默等多种重要的调控过程[3-4]。并且随着lncRNA的不断被发现，其在各种生物学过程及疾病中发挥的作用也越来越被关注。众多研究表明，在肿瘤细胞中，某些特定的lncRNA表达水平的改变与某些特定的生物学过程有密切联系。　　前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常见的恶性肿瘤。目前，对于中晚期的PCa患者，主要的治疗方法是抗雄激素治疗:使用雄激素受体拮抗剂或通过外科手术去势，经过抗雄激素治疗后大部分患者病情好转，但约两年左右几乎所有患者都会转变为雄激素非依赖前列腺癌(androgen-independentprostate cancer，AIPC)。而对于这样的患者临床上尚无有效的治疗方法，这也是目前PCa死亡率居高不下的主要原因。　　虽然目前对前列腺癌向激素非依赖转型的研究很多，但对于lncRNA在转型中的作用却鲜有报道。在本研究中，首先利用LNCaP细胞建立了激素非依赖前列腺癌LNCaP-AI细胞系，然后通过lncRNA芯片对两种细胞系进行比较分析，筛选与LNCaP细胞由激素依赖向非依赖转型相关的lncRNA。芯片结果显示总共有2381条lncRNA发生变化，其中表达上调的有1721条，表达下调的有660条。按照一定的筛选原则，如生物信息学知识，以及表达丰度、变化倍数等的分析，对其中的20条lncRNA进行qRT-PCR验证，随后在其他的前列腺癌细胞系再次验证，经过多次验证后将其中的9条lncRNA全部构建表达质粒进行功能学筛选，最后确定LOC283070作为研究对象。LOC283070是在LNCaP细胞向LNCaP-AI细胞转型过程中表达上调的lncRNA，进一步对其功能进行研究发现，无论是瞬时转染还是稳定高表达细胞系，LOC283070均可以促进LNCaP细胞的增殖和迁移能力，并且在无激素培基中培养时这一促进作用更加明显。另外体内实验也证实:无论是在正常雄性裸鼠体内还是在去势的雄性裸鼠体内，LOC283070均可促进肿瘤的生长。　　综上所述，本文建立了激素非依赖的前列腺癌细胞LNCaP-AI，通过芯片筛选了一系列与LNCaP转型相关的lncRNA，并通过qRT-PCR进行了验证。最后研究发现LOC283070可能在LNCaP细胞的转型过程中发挥作用，并对其分子机制做了初步的研究。　　第一部分 激素非依赖的LNCaP-AI细胞系的构建及鉴定　　研究目的:利用激素依赖的前列腺癌细胞系LNCaP细胞，通过在体外长期无激素环境中培养建立激素非依赖前列腺癌细胞系LNCaP-AI细胞，模拟前列腺癌在去势治疗后由激素依赖性向非依赖转变的过程，为进一步研究lncRNA在前列腺癌激素非依赖转型过程中的作用奠定基础。　　研究方法和结果:1、用含10％活性炭处理胎牛血清(CT-FBS)的无酚红RPMI1640培养基培养LNCaP细胞，经过长期传代，培养出能够适应无激素环境的LNCaP细胞亚系(LNCaP-AI)。2、鉴定LNCaP-AI细胞系:①在倒置显微镜下观察比较LNCaP和LNCaP-AI两细胞系的形态学差异。　　结论:1、成功构建出能适应无激素环境的LNCaP细胞亚系:LNCaP-AI细胞。　　2、经鉴定，显微镜下，LNCaP-AI细胞形态与LNCaP相比明显不同，细胞比较瘦小，欠饱满而且突触明显增多;而MTT实验和细胞生长曲线检测以及细胞周期检测均显示:LNCaP-AI细胞能明显适应无激素的环境。同时PSA检测结果显示LNCaP-AI细胞已经适应无激素的环境，恢复了PSA的分泌功能。进一步的RT-PCR检测PSA基因的表达结果表明LNCaP-AI细胞恢复了表达PSA的能力，但其表达水平仍低于在正常培基中生长的LNCaP细胞;RT-PCR和western-blot检测AR基因的表达，结果均显示LNCaP-AI细胞中AR的表达明显高于LNCaP细胞。　　第二部分 LNCaP-AI和LNCaP细胞lncRNA表达谱差异的检测及验证　　研究目的:应用lncRNA芯片检测LNCaP-AI和LNCaP细胞lncRNA及mRNA的表达谱，分析芯片结果，筛选两种细胞系中差异表达的lncRNA，对其进行验证。为进一步明确LNCaP细胞转型过程中lncRNA表达谱的改变及其发挥的作用奠定基础。　　研究方法和结果:1、制备LNCaP和LNCaP-AI细胞的总RNA样品做lncRNA芯片检测并分析检测数据。结果显示:芯片共检出29，566个lncRNA，和LNCaP相比LNCaP-AI表达上调的lncRNA有1721个，表达下调的lncRNA有660个。2、按照一定的筛选原则包括生物信息学资料、变化倍数、表达丰度等的分析，随机挑选20个差异表达的lncRNA，根据碱基序列，设计特异性引物，用qRT-PCR验证芯片结果。　　结论:1、lncRNA芯片显示:lncRNA在LNCaP和LNCaP-AI细胞系中存在差异表达，这一结果提示某些lncRNA可能在LNCaP细胞的转型过程中发挥一定的作用，但其具体功能尚需进一步的研究证实。　　2、在LNCaP、LNCaP-AI细胞，以及在其他激素非依赖的前列腺癌细胞系中进行的qRT-PCR验证，充分说明了芯片结果的可信性。　　第三部分 筛选在LNCaP细胞激素非依赖转型中发挥作用的lncRNA　　研究目的:在LNCaP细胞和LNCaP-AI细胞中过表达lncRNA，研究其在LNCaP细胞转型过程中的作用。　　研究方法和结果:1、经验证的9个lncRNA，根据基因数据库中的序列，设计克隆引物，用高保真酶通过PCR扩增其序列，构建表达质粒。经限制性内切酶酶切鉴定，克隆的片段大小符合，插入方向正确，DNA测序结果正确。2、将在LNCaP-AI细胞中表达上调的lncRNA，在LNCaP细胞进行过表达，然后在正常培基和去激素的培基中培养，通过MTT实验、计数法测定生长曲线、Hochest染色实验、transwell实验及流式细胞仪检测细胞周期分布实验，探究在LNCaP-AI细胞表达上调的lncRNA在LNCaP转型中所发挥的作用。　　结论:1、5种在LNCaP-AI细胞表达上调的lncRNA，只有LOC283070可能在LNCaP细胞的转型过程中发挥了作用:①过表达LOC283070后，在有/无激素环境中均能促进LNCaP细胞的增殖和迁移，在无激素的环境中促进细胞周期进程，并且在正常裸鼠和去势裸鼠体内都能促进肿瘤生长;②在LNCaP-AI细胞中干扰LOC283070表达后，细胞的增殖、迁移能力均受到抑制，同时细胞周期进程受到明显抑制。　　2、4种在LNCaP-AI细胞表达下调的lncRNA，除了AF085831可抑制LNCaP-AI细胞的增殖外，其余lncRNA对LNCaP-AI细胞的凋亡、迁移均无作用。　　第四部分 初步探究LOC283070在LNCaP细胞激素非依赖转型中的作用机制　　研究目的:通过biotin-RNA pull down实验寻找与LOC283070特异性结合的蛋白分子，进而初步阐述其作用机制。　　研究方法和结果:1、用生物素标记的RNA，将LOC283070表达质粒进行体外转录，之后与LNCaP-AI细胞的裂解液进行biotin-RNA pull down实验，拉下来的差异条带，进行质谱分析，然后根据生物信息学资料寻找相关的靶蛋白。结果显示:与LOC283070反义链组和空质粒对照组相比，LOC283070组存在明显的5条差异蛋白条带，蛋白质谱分析5条差异条带共得到10种蛋白，即每条带经质谱分析后都成功鉴定出与其相对应的蛋白。基于前面实验已证实的LOC283070在LNCaP细胞转型过程中的作用，并结合对所有蛋白功能的综合分析，最终选用PHB2蛋白进行后续研究。因为有文章报道，PHB蛋白在前列腺癌转型过程中发挥作用，PHB蛋白的降低可增加组蛋白乙酰化作用，提高雄激素受体对肾上腺激素的活性，从而促进前列腺肿瘤向激素非依赖型转化。2、westernblot检测LOC283070与PHB2结合的特异性，biotin-RNA pull down实验拉下来的样品经SDS-PAGE电泳分析后用PHB2蛋白抗体孵育。结果表明，LOC283070的确可以结合于PHB2蛋白。3、为进一步证明LOC283070特异性结合于PHB2蛋白，又进行了体内结合实验，即RNA免疫共沉淀(RIP)，用PHB2的抗体与LNCaP和LNCaP-AI细胞的裂解液进行了免疫共沉淀实验，之后利用RT-PCR方法检测LOC283070。　　结论:1、biotin-RNA pull down实验和RIP实验初步证实了LOC283070和PHB2蛋白在体内结合的特异性;　　2、PHB2蛋白可抑制LNCaP-AI细胞的增殖与迁移，并且明显抑制细胞周期进程;LOC283070可能通过抑制PHB2蛋白的功能，参与LNCaP细胞的转型过程。