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目的:多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种好发于青壮年致残性中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)脱髓鞘疾病,目前还没有明确的发病机制和有效的治疗方法。MS的动物模型主要有两种:实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)和双环己酮草酰二腙(Cuprizone)模型。EAE是最常用的MS模型,但其主要用于研究MS免疫失调的机制和寻找有效的免疫调节药物。而Cuprizone则主要作用于少突胶质谱系的细胞,是研究髓鞘脱失及再生的动物模型。有研究认为激活的小胶质细胞(microglia,MG)清除髓鞘碎片,具有髓鞘保护作用,但也有研究认为炎性MG释放的炎性物质,具有髓鞘损伤作用。寻找具有改善MG功能的化合物,是发现髓鞘保护和再生药物的一个重要研究方向。丹参具有活血祛瘀、祛瘀止痛、安神宁心等功效,是治疗MS中药方剂中常见的一味中草药。二氢丹参酮Ⅰ(Dihydrotanshinone I,DHT)是丹参的一种有效成份,目前尚无DHT对MS的治疗的研究。本课题以8周龄雄性C57BL/6小鼠为对象,喂食含0.2%Cuprizone的饲料制备脱髓鞘动物模型,DHT进行灌胃治疗,通过比较CMC-Na正常组、CMC-Na模型组和DHT干预组的CNS内的髓鞘脱失和MG的极化情况。探讨DHT对髓鞘的保护作用和机制。方法:(1)体内实验,8周龄雄性C57BL/6小鼠24只,随机分为CMC-Na正常组、CMC-Na模型组和DHT干预组,每组8只。含0.2%Cuprizone的饲料饲喂制备脱髓鞘模型;第15天起,开始给药处理:CMC-Na正常组予以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液,继续饲喂无Cuprizone的饲料;CMC-Na模型组给予0.5%CMC-Na溶液,继续饲喂含Cuprizone的饲料;DHT干预组,灌胃DHT(25 mg/kg/天,溶解于0.5%CMC-Na溶液),继续饲喂含0.2%Cuprizone的饲料。直到第42天,麻醉处死,分离取出脑组织制备冰冻切片,因为Cuprizone诱导的脱髓鞘病变部位主要在胼胝体区,因此,下边所有实验仅观察此区。通过LFB组织化学染色、MBP和PLP的免疫荧光染色检测髓鞘完整性,TUNEL标记细胞凋亡,Iba-1、CD86和CD163免疫荧光染色检测体内MG极化。(2)体外培养SIM-A9 MG,实验分为CMC-Na对照组、DHT对照组、CMC-Na+LPS刺激组和DHT联合LPS干预组。细胞贴壁1.5 h后,用LPS(终浓度25 ng/ml)刺激4 h后,加入CMC-Na(0.005%)或DHT(100 nM),继续培养24 h。每个组设置3个复孔,并重复3次。然后,收取细胞进行CD14、CD16/32、TNF-/、iNOS、CD206、IL-10和Arginase-1染色,流式细胞术检测SIM-A9 MG的M1与M2型极化。结果:1.LFB组织化学染色、抗MBP和PLP抗体免疫荧光染色实验标记小鼠大脑胼胝体区髓鞘,显示了相似的结果,与CMC-Na正常组比较,0.2%Cuprizone诱导了80%的髓鞘丢失,而给予DHT后,仅约60%的髓鞘丢失,DHT干预明显抑制Cuprizone诱导的脱髓鞘现象。2.TUNEL通过与核酸3`-OH结合,能显示细胞凋亡状况,课题组通过TUNEL染色实验标记大脑胼胝体区细胞凋亡情况,结果显示,与CMC-Na正常组比较,0.2%Cuprizone诱导了大量的细胞凋亡(p<0.01),而给予DHT后,凋亡细胞数明显减少(p<0.01)。3.使用抗GFAP抗体标记大脑胼胝体区星形胶质细胞情况,结果显示,0.2%Cuprizone诱导了明显的星形胶质细胞激活,给予DHT后,仍有大量的星形胶质细胞激活,与CMC-Na模型组无明显差异。4.使用抗MBP和Iba-1抗体双色免疫荧光染色,分别标记大脑胼胝体区髓鞘和MG,结果显示,与CMC-Na正常组比较,0.2%Cuprizone对Iba~+MG数目无明显影响,但MG胞体明显变大,成为阿米巴样MG,CMC-Na模型组阿米巴样MG的面积明显增加,给予DHT后,阿米巴样MG的面积明显减小(p<0.05)。5.进一步使用抗CD86、CD163抗体检测了大脑胝胝体区MG的表型,结果显示,与CMC-Na正常组比较,CMC-Na模型组中CD86~+MG数量更多,CD163~+MG数量无差异;在DHT干预组中,与CMC-Na正常组比较,CD86~+MG和CD163~+MG数量明显增多;但与CMC-Na模型组比较,CD86~+MG数量更少,CD163~+MG数量明显增多;分析CD86~+MG数量与CD163~+MG数量的比值,CMC-Na正常组接近于1,CMC-Na模型组明显升高,DHT干预组明显低于1,显示DHT使得MG的平衡向M2型MG转变。6.使用SIM-A9小胶质细胞系进行验证,结果显示LPS刺激明显诱导了CD16/32~+、iNOS~+、TNF-α~+、CD206~+和IL-10~+细胞百分比增加(p<0.01),DHT干预LPS刺激后,明显地降低了CD16/32~+、iNOS~+、TNF-α~+细胞百分比(p<0.05),然而并未明显增加CD206~+、IL-10~+和Arginase~+细胞百分比;对M1与M2细胞数的比值进行分析,结果显示,与CMC-Na对照组、DHT对照组比较,LPS组MG的平衡向M1倾斜,DHT联合LPS干预组,MG的平衡向M2倾斜。结论:饲喂Cuprizone导致小鼠CNS胼胝体区出现明显的脱髓鞘,明显地诱导细胞凋亡,星形胶质细胞和MG明显的激活,激活的MG的平衡向M1倾斜;DHT干预可以明显地减少Cuprizone诱导的脱髓鞘现象,明显地减少细胞凋亡,对星形胶质细胞的激活没有影响,体内体外实验均证明DHT可以部分抑制MG的激活,使得MG的平衡向M2倾斜。说明DHT可能通过促进MG转变为M2型,减轻CNS炎症反应,发挥髓鞘保护作用。