阿尔兹海默症是进行性认知功能障碍为主要特征的原发性中枢神经系统退行性疾病,患者大脑海马区和皮质区会出现神经元和神经突触功能障碍或死亡,严重危害老年人的健康。典型的病理特征为脑皮质广泛性萎缩,细胞外沉积大量β淀粉样蛋白（Amyloidβpeptide,Aβ）形成老年斑,脑神经元胞浆内出现Tau蛋白异常聚集而形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangle,NTF）。Aβ是淀粉样前体蛋白APP（AmyloidβPrecursor Protein,APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶顺序切割形成,Aβ的主要组成成分包括Aβ40和Aβ42,其中Aβ42更容易聚集,并具有细胞毒性。由此可见,经APP切割形成Aβ的过程中β-分泌酶起到了关键作用。早衰因子PS1是γ-分泌酶的活性中心,同样参与了APP的水解过程,并且有大量研究表明在缺乏PS1的细胞中γ-分泌酶水解APP的活性会受到抑制。本课题组前期研究表明PS1与BACE1蛋白具有共定位现象,并且PS1的缺失会抑制BACE1蛋白的活性,使C末端产物表达水平下降。基于此发现提出假设:PS1能够调控BACE1蛋白的表达水平与活性,来影响APP的水解切割水平。基于此假说,进一步开展PS1对BACE1蛋白表达水平与活性的相关机制研究,并筛选与BACE1具有相互作用的蛋白,为进一步研究AD的发病机制提供理论机制。本课题,重点研究PS1对BACE1蛋白表达水平与活性的影响,对BACE1蛋白在细胞内转运的影响,FAD相关PS1突变对BACE1活性以及APP水解切割过程的影响,筛选与BACE1具有相互作用的蛋白,并获得兴趣蛋白,研究其与BACE1蛋白的相互作用以及对APP水解切割过程的影响。通过本文的研究,对上述假说提供实验数据。本研究取得了以下成果:1、采用双向免疫共沉淀,免疫细胞化学（包括MEF,原代神经元细胞）方法确定BACE1蛋白与PS1具有相互作用;淀粉样前体695野生型和Swedish突变体的cDNA瞬时转染到MEF细胞中,与对照组比较发现PS1的缺失会导致BACE1丧失活性。瞬时转染PS1到MEF细胞后,BACE1的蛋白水平和mRNA水平显著上调,并且荧光素酶双报告系统显示这种转录水平的上调是由于PS1能够上调BACE1的启动子区活性所引起的。当加入γ-分泌酶抑制剂L-685,458后,可以很好的反转MEF PS1^-/-PS2^-/-细胞中瞬时过表达PS1后所产生的影响。以上结果都表明早衰因子PS1能够对BACE1进行调控。2、成功采用蔗糖密度梯度离心法分离亚细胞器,然后采用Western Blot进行检测,发现在转染PS1后,BACE1蛋白蛋白在第4层的分布明显增加,同时第3层BACE1蛋白分布显著上调,表明BACE1蛋白发生了向第3层迁移的现象,在第3层中主要亚细胞成分为内质网,因此PS1会改变BACE1蛋白的亚细胞分布,使其延长在内质网的停留时间。同时采用免疫荧光化学的方法和Time-lapes方法检测未转染PS1后,BACE1蛋白均匀分布在胞浆,而且与内质网,高尔基体网络和早期内含体只有少量的共定位。而在转染PS1后,BACE1蛋白明显向细胞核周围迁移,并与Calnexin出现大量共定位,说明PS1会使内源性BACE1蛋白向内质网迁移,这与亚细胞组分分离实验结果一致,同时转染了PS1后都显著增加了BACE1蛋白与Syn-6和EEA1的共定位,这表明PS1可以促进BACE1蛋白在高尔基体的修饰成熟,而在早期内含体中,BACE1蛋白可以与APP相互作用,这说明瞬时转染PS1可以促进BACE1蛋白与APP的结合,发挥BACE1蛋白的功能。以上结果表明早衰因子PS1会使BACE1蛋白延长停留在内质网的时间,促进BACE1蛋白在高尔基体和内质网的分布,所以PS1可能通过改变BACE1前体蛋白的合成及成熟影响BACE1蛋白的分布及其活性。3、成功构建了16个家族性PS1突变,瞬时转染到2EB2细胞中,Western Blot和ELISA检测APP水解切割通路过程中相关蛋白的表达水平,发现除了显性负效应突变外其他的PS1突变可以显著增加APP的水解切割,增加CTFs的切割水平,增加Aβ42/Aβ40的比例。所选的PS1突变中,一部分可以通过增加BACE1启动子的活性增加BACE1蛋白的表达水平来增加APP的水解切割过程,另一部分则通过增加BACE1的活性来增加APP的水解切割过程。采用LC-MS/MS定量检测PS1突变切割Aβ49或Aβ48两条途径中特异性肽段的水平。结果发现PS1突变:I143V,M146V和S170F在三种切割途径（C99,C83及APP切割途径）中具有相同的切割作用;M233V,I143T,H163P,I381V和L392V在C99切割过程中,Aβ48-Aβ38切割途径和Aβ49-Aβ40切割途径共同作用促进了Aβ42/40比例的增加,而在C83切割途径中,Aβ48-Aβ38切割途径占据主要优势作用,所以在APP整个切割过程中,Aβ48-Aβ38切割途径成为了主导切割途径;ΔE9,G217A,Q223R和G384A在C99和C83切割途径对APP的切割途径具有协同作用,因此不同的PS1突变对长Aβ具有一定选择性。4、利用免疫共沉淀与质谱联用的方法,检测了与BACE1相互作用的蛋白,通过采用peaks软件在swissprot数据库中检索,共发现已有功能报道的蛋白891个,并对其进行了生物学过程及通路分析,并筛选到了靶标蛋白ZNF335,通过双向的免疫共沉淀,免疫细胞化学的方法进行了验证。通过瞬时转染ZNF335检测其对APP水解切割过程的影响,结果显示当瞬时转染ZNF335和BACE1后,可以促进BACE1的表达水平,APP的水解切割,CTFs的表达量以及Aβ42的分泌水平。Real-time PCR结果显示与正常老年人相比较,AD病人以及AD模型鼠脑内ZNF335 mRNA水平显著上调。同时发现ZNF335主要分布在神经元内,并且随着小鼠年龄的增长,在脑内皮质区和海马区的分布显著减少。5、成功构建了shZNF335敲低AD动物模型,免疫组织化学显示与随机组相比较shZNF335组的ZNF335的水平显著降低。水迷宫实验对敲低ZNF335脑内的AD小鼠行为学进行检测,结果发现敲低ZNF335脑内可以显著性的增加小鼠的学习记忆能力,缩短小鼠的逃逸时间以及逃逸线路。脑内老年斑染色结果显示随着年龄的增加,AD小鼠模型脑内Aβ的表达水平显著上调,在敲低ZNF335基因后,AD小鼠脑内Aβ的表达水平显著下调。以上结果显示ZNF335蛋白具有调控BACE1活性,可以影响APP水解切割通路进而影响Aβ的表达水平。