论文部分内容阅读
目的:本实验通过慢病毒介导抑制/过表达miR-23a-3p、沉默LRP5来探讨miR-23a-3p在人牙周膜干细胞(HPDLSCs)成骨分化过程中的作用机制,预测miR-23a-3p的分子靶标,并深入研究miR-23a-3p、LRP5与HPDLSCs在成骨分化过程中的相互关系,为探索正畸牙周骨改建的机制提供一定的理论依据与新思路。方法:1.收集临床上12-20岁因正畸拔除的前磨牙,采用组织块培养法获取原代细胞,并通过有限稀释法分离纯化HPDLSCs,为后续实验提供细胞。进而通过细胞形态学观察、CCK8法检测细胞增殖能力、细胞集落克隆形成率(CFU-F)检测、流式细胞仪鉴定细胞表面分子标志物、免疫荧光化学染色法及成骨成脂诱导分化实验等方法鉴定细胞。2.取生长状态良好的2-3代HPDLSCs接种于六孔板并诱导其成骨分化。在诱导 0d、3d、5d、7d、14d、21d 后通过 RT-qPCR、WB 检测 LRP5mRNA和LRP5蛋白表达的变化量。3.构建过表达与抑制miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒载体,设置不同组的MOI=20、50、80、100转染HPDLSCs,选出转染HPDLSCs的最佳MOI;以测出最佳的MOI病毒转染HPDLSCs,通过CCK8法检测miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒载体对HPDLSCs增殖能力的影响。4.miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs,经嘌呤霉素筛选后,通过RT-qPCR检测LRP5、miR-23a-3p基因的表达,以明确miR-23a-3p、shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs后miR-23a-3p的抑制及过表达效果、沉默LRP5的效率,筛选出沉默LRP5基因的最佳靶点。5.慢病毒转染HPDLSCs成功后诱导HPDLSCs成骨分化,诱导成骨7d后检测各组miR-23a-3p的变化,并通过RT-qPCR检测LRP5、ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测LRP5、ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组:Blank 组(空白对照组)、miR-23a 组(miR-23a-3pmimicsgroup)、miR-23aNC 组(miR-23a-3p mimics negative control group)、miR-23aI 组(miR-23a-3p inhibitor group)、miR-23aNCI 组(miR-23a-3p inhibitor negative control group)。6.shRNA-LRP5慢病毒转染HPDLSCs后诱导HPDLSCs成骨分化,诱导成骨7d后通过RT-qPCR检测ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组:shNC组(阴性对照组)、shLRP5组(shRNA-LRP5 group)。7.通过shRNA-LRP5慢病毒介导沉默LRP5基因后转染miR-23a-3p慢病毒,成功抑制miR-23a-3p后诱导HPDLSCs成骨分化,7d后通过RT-qPCR检测LRP5、ALP、RUNX2基因的表达情况、WB检测LRP5、ALP、RUNX2蛋白的表达情况。实验分组:NC+shNC组(阴性对照组)、miR-23aI+shNC组(miR-23a-3p inhibitor+shRNA-LRP5 negative control group)、miR-23aI+shLRP5 组(miR-23a-3p inhibitor+shRNA-LRP5 group)。结果:1、本实验所获取的HPDLSCs形态呈纺锤长梭形、以放射状排布从组织块向外生长,进行有限稀释纯化后获取稳定的HPDLSCs备后续实验使用;细胞增殖呈指数型增长;细胞克隆实验表明细胞有较高的克隆形成率15%;流式细胞检测及免疫荧光染色结果表明实验所获取的HPDLSCs来源于间充质;成骨诱导后可见矿化结节形成,成脂诱导可见“葡萄串样”分布的圆形脂滴形成。2、与未诱导的0d组相比,HPDLSCs在成骨诱导过程中LRP5的基因及蛋白的表达量均逐渐上升,其中LRP5 mRNA与蛋白的表达量在7d达到最大值,之后逐渐下降。与0d相比,3d、5d、7d、14d的LRP5 mRNA表达差异显著(p<0.01)。3、慢病毒转染HPDLSCs72h后,可测出转染的最佳MOI=20,此时细胞生长状态良好,于荧光显微镜下可见红、绿荧光表达率达85%以上,经CCK8检测,慢病毒载体对HPDLSCs增殖能力无影响。4、经RT-qPCR检测,与阴性对照组相比,miR-23a组病毒转染HPDLSCs上调 miR-23a-3p 高达 475.24%,miR-23aI 组病毒转染 HPDLSCs 下调 miR-23a-3p达34.05%(p<0.05);与阴性对照组相比,shLRP5-1组病毒转染HPDLSCs 沉默 LRP5 的效率为 97.19%,shLRP5-2 为 84.14%,shLRP5-3 为92.69%(p<0.01),可得出shLRP5-1为沉默LRP5基因的最佳靶点。成功构建慢病毒介导的抑制/过表达miR-23a-3p的模型、沉默LRP5基因的模型。5、与 Blank 组相比,miR-23aNC 与 miR-23aNCI 组中 miR-23a-3p 的表达差异不明显(p>0.05),miR-23a组中miR-23a-3p的表达明显增加(p<0.01),miR-23aI组中miR-23a-3p的表达明显降低(p<0.01);与阴性对照组相比,miR-23a组中LRP5、ALP、RUNX2的蛋白表达均下降,miR-23aI组中LRP5、ALP、RUNX2的蛋白表达均增加;与对照组相比,miR-23a组中 LRP5、ALP、RUNX2 的 mRNA 表达均下降,miR-23aI 组中 LRP5、ALP、RUNX2的mRNA表达均增加,差异均有统计学意义(p<0.01)。6、与shNC组相比,shLRP5组的ALP、RUNX2的mRNA、蛋白表达水平均下降(p<0.01)。7、与 NC+shNC 组相比,miR-23aI+shNC 组 ALP、RUNX2 的 mRNA、蛋白表达均增加,除RUNX2的蛋白差异不明显外,其余差异显著(p<0.05);与 miR-23aI+shNC 组相比,miR-23aI+shLRP5 组 ALP、RUNX2 的 mRNA、蛋白表达均下降(p<0.05)。结论:1、本实验成功分离培养并提纯HPDLSCs,在诱导HPDLSCs 21d成骨分化中验证了 LRP5与HPDLSCs成骨分化具有相关性。2、本实验成功构建慢病毒介导的抑制/过表达miR-23a-3p基因模型,从基因与蛋白水平再次验证了 miR-23a-3p可能在HPDLSCs成骨分化过程中起负向调控作用。3、本实验成功构建慢病毒介导的“抑制miR-23a-3p/沉默LRP5”基因模型,从基因与蛋白水平验证miR-23a-3p可能通过靶向于LRP5负向调控HPDLSCs的成骨分化。