多年来,作为elicitin家族成员之一的ParA1蛋白(也称为parasiticein)以其能够在烟草上诱导过敏反应(hypersensitive response, HR)而受到研究人员的广泛关注。但是在本研究中,我们发现ParA1诱导的细胞死亡被共同注射的核黄素所抑制,并且该抑制现象只在光照条件下出现(在避光条件下则没有)。经过多次表型重复和生理生化检测,我们证实了上述抑制现象不是暂时的延缓HR信号传递,而是彻底地将HR信号阻断所致。在表型确定之后,我们进行了逐步深入的探索,结果发现,是活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)之一的羟自由基(hydroxyl radical, OH)参与了负向调控该HR的过程。另外,为了研究核黄素在植物体内的功能,尤其是它对氧化还原调控的作用,我们在拟南芥中异源表达了动物的核黄素受体蛋白(riboflavin binding protein, RfBP),试图调控植物体内核黄素的含量。结果发现由于体内黄素水平被改变,增强了转基因植株对毒性菌株Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000的抗性。1.蛋白类激发子ParA1的表达纯化及生物活性分析Elicitin类蛋白质激发子在其被发现至今,一直被作为探索植物-病原物互作、植物抗病信号转导的基本材料和系统。本研究所使用的ParAl蛋白也是elicitin类蛋白激发子家族的成员之一。为后续研究的使用,我们采用原核和真核两套表达系统分别对该蛋白进行表达。在烟草品种NC89上,我们对表达后的蛋白进行了生物活性分析,发现采用原核表达的ParA1粗提蛋白诱导HR的能力远不如用真核酵母系统表达的强。因此,我们使用了表达量较高的酵母表达系统对ParA1蛋白进行表达,并对表达产物进行镍离子柱纯化。经Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳和生物活性分析表明,纯化后的蛋白浓度达到6500 nM,并且电泳条带清晰、单一,在稀释6000倍后仍可以强烈诱导HR症状。这为本论文后续章节的研究提供了很好的研究材料。另外,本章节也就原核表达系统中ParA1蛋白表达量不高的原因进行了分析,初步认为主要原因有二：一是ParA1蛋白中含有三对二硫键,而二硫键数量较多的蛋白在原核表达中的正确折叠比较困难；二是原核表达的、正确折叠的ParA1蛋白对其表达宿主的生长有较强的抑制能力。2.光敏化的核黄素对ParA1诱导细胞死亡的抑制作用在烟草属栽培品种NC89 (Nicotiana tabacum L. cv NC89)的叶片上,外源激发子ParA1注射后能够诱导HR的发生,但是这一HR过程可以被共同注射的核黄素所抑制,并且该抑制现象只发生于光照条件下。在黑暗条件下,HR过程则不能被抑制。利用trypan blue染色,我们发现在核黄素与ParA1共同处理的区域其细胞坏死程度要显著低于ParA1单独处理的区域。另外,通过对不同处理区域离子渗漏的48小时连续观测,证实了上述抑制现象不是延迟HR的出现而是彻底将其发展阻断所致。我们对各不同处理区域在不同时间段进行了半定量反转录PCR(semi-quantitative RT-PCR)分析,也得到了一致的结论。因为核黄素是一种重要的维生素,同时也是一种很好的光敏试剂,这使我们想到：很可能是核黄素的光解产物在起作用。于是,我们将事先光照并完全降解的核黄素溶液与ParA1混合注射,并将处理的植株置于光照条件下。但结果显示,这些降解后的产物并不能抑制HR的发生。该结果说明,只有在光解过程中,核黄素才具有抑制HR发展的作用。那么,核黄素是在HR信号传递的哪个阶段发挥抑制作用呢?通过光/暗交替处理的实验,我们证明了核黄素的抑制作用不是通过影响ParA1与其受体的接触识别所致,而是发生在接触识别阶段下游的、早期的HR信号传递过程当中。3.核黄素光敏化产生的羟自由基抑制了ParA1诱导的HR过程前文已经证实,核黄素本身及其光降解产物并不能抑制ParA1诱导的HR。于是,我们将研究的重点放到相关活性氧上,因为核黄素在光照下可以产生多种活性氧物质(ROS)。通过各种不同ROS清除剂与ParA1+核黄素的共同处理,我们发现：分别作为超氧阴离子(O2·-)和单线态氧(1O2)清除剂的过氧化物岐化酶和L-组氨酸不能恢复HR表型,而作为过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH-)清除剂的过氧化氢酶、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以及腺嘌呤和硫脲可以很好的恢复被抑制的HR症状。这就说明H2O2或OH·参与了HR的抑制过程。在进一步的实验当中,我们发现只有OH·处理可以重现HR的抑制现象,而且又因为OH·产生在H2O2的下游,因此我们初步认为找到的OH·就是HR的抑制因子。为了确认OH·的作用,我们通过电子顺磁共振波谱法(electron paramagnetic resonance, EPR)测定了核黄素在光照下的体外、体内OH·的产生情况,结果显示核黄素在光照条件下能够产生OH·,并且OH·的产生与HR被抑制的现象成正相关。4.植物内源产生的羟自由基对ParA1诱导细胞死亡的抑制作用核黄素在光照条件下产生的OH‘可以抑制ParA1诱导的细胞死亡,那么植物自发产生的OH‘是否还能具有相同的效果呢?而且,为了解析OH‘在植物体内可能的作用方式,这也是我们所面临的、不可回避的问题。有研究表明,用高浓度脱落酸(abscisic acid, ABA)预处理或自然干旱胁迫处理植物可以显著提高植物细胞产生OH‘的机率。因此,在本章研究中我们采用了上述的两种预处理方法。结果显示,在高浓度ABA预处理24小时的植株上,ParA1诱导的HR细胞死亡被显著地抑制。通过H2O2清除剂或OH‘清除剂的共同注射,HR的症状又可以完全被恢复。并且在ABA预处理的植株上,核黄素的共同注射处理能够进一步增加HR被抑制的程度。电子顺磁共振波谱法(EPR)的结果显示,ABA预处理的植株在注射ParA1之后,OH水平较对照处理有20%左右的提升。在干旱预处理的植株上,也能观察到相似的结果。因此,我们认为植物内源产生的OH同样具有抑制HR发展的作用。另外,我们发现核黄素不能抑制激发子HrpNEa诱导的细胞死亡,因此我们猜测OH‘可能只能在ParA1依赖的HR信号通路上起作用。最后,根据前人的研究以及对本实验的一些认识,我们就OH’可能的信号作用方式做了一个简单的设想。5.核黄素受体蛋白过表达拟南芥植株的转录组分析为了研究核黄素在植物体内的功能,尤其是它对氧化还原调控的作用,我们在拟南芥中表达动物源的RfBP蛋白,试图降低植物体内核黄素的含量。通过高效液相色谱(HPLC)检测发现,在核黄素受体蛋白过表达拟南芥(RfBP-expressing Arabidopsis thaliana, REAT)品系中,虽然黄素(flavin)总量升高了,但大部分都是被RfBP结合的状态,真正可用的游离态核黄素或黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的含量却被明显降低了。核黄素参与了细胞内的50多个生理生化过程,为了找到一个好的、表型明显的研究切入点,我们首先对转基因植株进行了全基因组芯片分析。芯片分析后的结果显示：(1)线粒体中负责电子传递的多数基因表达量下调,其中的13个下调2倍至更多；(2)参与氧化还原调控的谷氧还蛋白相关基因表达量下调；(3)负责蛋白质翻译及其定位的相关基因发生表达下调；(4)参与DNA合成和染色质结构组成的组蛋白以及核小体组装的相关转录本在转基因植株中被下调表达。由于体内黄素水平被改变,造成了植株对氧化还原平衡控制能力减弱,表现出对毒性菌株PstDC3000抗性增强。