山茶属植物共生放线菌次级代谢产物及其抗癌抑菌活性初步探究

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植物共生放线菌是天然药物的重要来源。山茶属植物(Camellia)是重要的药用植物,富含多种次级代谢产物,如茶氨酸、茶皂素、茶多酚、儿茶素、花青素、咖啡碱和各种有机酸等。目前关于山茶属植物次级代谢产物及其合成途径的研究已经相对成熟,然而山茶属植物共生放线菌及其代谢产物的相关研究尚处于起步阶段。本试验以山茶属植物中分离的共生放线菌为研究对象,通过体外活性检测,筛选出具有抗癌或抑菌活性的菌种资源,进一步结合生物信息学技术进行基因组挖掘,探索活性菌株的次级代谢潜力,以此指导后期对生物活性成分的分离、纯化和结构解析,以期获得具有良好活性的先导化合物,丰富放线菌天然产物资源库。第一,本研究利用多种分离培养基从23个山茶属植物品种的根和嫩叶中分离出45株分属于8个科11个属的放线菌,其中链霉菌属最多(占47%),这与许多其它植物共生放线菌的研究结果一致。对筛选到的放线菌进行发酵培养,制备发酵粗提物,用于后续抗癌和抑菌活性筛选。第二,以人结直肠腺癌上皮细胞DLD-1、人肺癌细胞A549、人胃癌细胞AGS和鼠源结直肠癌细胞MC38作为指示细胞,以MTS法检测放线菌发酵粗提物对指示细胞的抑制作用。结果表明,链霉菌(XY555、XY556、XY598、XY611和XY625)和微杆菌XY607这6株放线菌能较好地抑制指示细胞的增殖。进一步利用结晶紫检测法对阳性菌株的抑癌效果进行验证,结果与MTS一致,表明这6株放线菌代谢产物对癌细胞的增殖具有良好的抑制效果。第三,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003和大肠杆菌Escherichia coli BL21为细菌指示菌,以尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4、茶树炭疽菌Colletotrichum sp.和茶树拟盘多毛孢Pestalotiopsis sp.为真菌指示菌,通过平板拮抗试验,筛选具有抑菌活性的山茶属植物共生放线菌。研究结果表明,链霉菌XY602对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性最好,抑菌圈为8.0-17.0 mm。遗憾的是,未能筛出具有良好抗真菌活性的菌种。第四,利用antiSMASH在线数据库对链霉菌XY602和XY611基因组中与次级代谢产物合成相关的基因簇进行预测分析,结果表明这2株菌株都具有数量繁多(XY602:65个,XY611:38个)且种类丰富的次生代谢生物合成基因簇。通过序列分析,推测XY602的抑菌活性物质可能由多环特特拉姆酸大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactams,PTMs)类化合物合成基因簇编码。XY611的抗癌活性物质可能由萜类合成基因簇或铁载体合成基因簇编码。这为后续的天然产物纯化及结构解析提供了数据参考。第五,以抗癌或抑菌活性为指导,利用甲醇、乙酸乙酯、正丁醇萃取和半制备高效液相色谱(HPLC)的方法对链霉菌XY602和XY611的发酵粗提物进行初步纯化,通过UPLC-QTOF MS解析抗癌或抑菌活性成分的结构信息,并与GNPS微生物天然产物质谱数据库进行比对,结合菌株次生代谢基因簇分析,结果表明XY602有效抑菌成分可能为一个新颖的环脂肽类物质,有待后续分析。XY611的样品纯度不足,其抗癌活性成分有待进一步解析。综上所述,本试验在山茶属植物中分离并筛选得到了具有抗癌抑菌活性的山茶属植物共生放线菌,并初步对这些菌株进行次级代谢合成基因簇和活性成分解析,为后期抗癌抑菌活性化合物的挖掘提供了菌种资源和数据参考。
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