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目的:考察改良癌痛消方(I-ATXP)对不同肝癌细胞的增殖抑制、细胞凋亡和周期的调控作用,及对肝癌细胞来源外泌体分泌的影响,为下一步探讨I-ATXP能否通过对肝癌细胞来源外泌体的作用来调控肝癌细胞的生长增殖奠定基础。方法:(1)改良癌痛消方(I-ATXP)对不同肝癌细胞增殖的影响作用:将不同浓度的I-ATXP(0.125-1 mg/ml)分别作用不同肝癌细胞HepG2、SMMC7721、HKCI-C3和无癌活性的永生化肝细胞MIHA细胞24、48和72 h后,利用CCK-8法来检测药物对细胞的毒性作用和细胞增殖的影响。(2)改良癌痛消方(I-ATXP)对不同肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响:将不同浓度的I-ATXP(0.125-1 mg/ml)分别作用HepG2、SMMC7721、HKCI-C3细胞24 h后,用Annexin V-FITC/PI双染法和PI单染法分别检测药物对细胞凋亡的影响及细胞周期的调控作用。(3)改良癌痛消方(I-ATXP)对肝癌细胞来源外泌体分泌的影响作用:将不同浓度的I-ATXP(0.125-1 mg/ml)分别作用HepG2、SMMC7721、HKCI-C3细胞24 h后,收集细胞培养上清,提取肝癌细胞来源的外泌体,通过乙酰胆碱酯酶(AchE)试验来检测肝癌细胞外泌体分泌量的变化,Western blot检测外泌体特异性蛋白CD63和Alix的表达水平变化。结果:(1)不同浓度的I-ATXP处理24、48和72 h后,三种肝癌细胞的IC50值均显著小于MIHA的IC50值,尤其是在药物作用24 h后,MIHA细胞的IC50值为5.052±0.229 mg/ml,为三种肝癌细胞的2倍多,说明I-AXTP对肝癌细胞具有细胞毒性作用。(2)不同浓度的I-ATXP对HepG2、SMMC7721、HKCI-C3和MIHA细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,并且对无癌活性永生化肝细胞MIHA的抑制效果明显低于肝癌细胞。(3)SMMC7721和HKCI-C3的细胞凋亡率随着I-ATXP的浓度增加而升高,存在明显的浓度依赖性。HepG2细胞的凋亡比例与空白对照组相比,也均有显著升高(P<0.001)。因此,I-ATXP能够诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721和HKCI-C3发生细胞凋亡,但是凋亡程度存在不同。(4)不同药物浓度的I-ATXP(0.125-1 mg/ml)处理细胞24 h后,G0/G1期HepG2、SMMC7721、HKCI-C3的细胞比例均显著升高(P<0.01),说明I-ATXP对肝癌细胞HepG2、SMMC7721和HKCI-C3具有明显的周期抑制作用,能诱导细胞发生G0/G1期周期阻滞。(5)不同浓度的I-ATXP(0.125-1 mg/ml)作用24 h后,三种肝癌细胞来源外泌体的AchE值均显著降低(P<0.01)。并且与5-Fu相比,在现有的浓度条件下,I-ATXP处理组的抑制效果较弱。(6)不同浓度I-ATXP(0.125-1 mg/ml)作用于细胞24 h后,三种肝癌细胞来源外泌体均能表达外泌体特异性蛋白Alix和CD63,但与空白对照组相比,Alix和CD63蛋白的表达水平随着药物浓度增加而减少,说明I-ATXP能抑制肝癌细胞HepG2、SMMC7721和HKCI-C3来源外泌体特异性蛋白Alix和CD63的表达。结论:(1)改良癌痛消方(I-ATXP)对肝癌细胞HepG2、SMMC7721、HKCI-C3增殖具有明显的抑制作用,并具有药物作用时间和浓度相关性。与阳性药氟尿嘧啶(5-Fu)相比,改良癌痛消方对细胞的增殖抑制作用更具有选择性和特异性,这也是中药治疗肿瘤的优势所在,为临床治疗提供了实验依据。(2)改良癌痛消方(I-ATXP)可以诱导肝癌细胞发生细胞凋亡和G0/G1期阻滞。结合细胞增殖实验结果表明I-ATXP可通过诱导肝癌细胞凋亡及周期阻滞来调控肝癌细胞的生长与增殖。(3)改良癌痛消方(I-ATXP)能抑制肝癌细胞来源外泌体的分泌及外泌体特异性蛋白CD63和Alix的蛋白表达,提示I-ATXP有可能通过肝癌细胞来源外泌体,实现对肝癌细胞的调控。