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金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、高巯基含量、富含半胱氨酸、无芳香氨基酸、无组氨酸、无二硫键的内源性蛋白。其特殊的理化性质与结构及独特的生物学功能在疾病的发生、发展、诊断及发病机制探讨中显示了重要作用，MT的生物学效应迄今尚未完全阐明，比较明确的是调节金属离子代谢、重金属解毒及清除氧自由基抗氧化等功能。而脑缺血是一种严重危害人们健康的疾病，缺血后的病理生理变化是一个多因素参与的复杂过程，因缺血再灌注损伤发生机理及其防护措施的研究对外科手术、离体器官保存、器官移植等具有重要应用价值，目前对其机制尚未明了，通常认为与氧自由基、钙超载、细胞凋亡等有关。
本研究在前期工作的基础上，利用医学实验中心提供的中华绒鳌蟹金属硫蛋白的基因工程菌，通过优化的诱导表达条件，诱导重组质粒，大量表达融合蛋白，然后通过Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析分离纯化以获得高纯度的无有害内源毒素的金属硫蛋白。在此基础上研究MT对新西兰兔的抗氧化能力及其对长爪沙鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。
材料和方法:
1.蟹重组金属硫蛋白的诱导表达和分离纯化
1．1在前期研究已构建的重组质粒及优化基因工程菌表达条件的基础上，进行大量工程菌的制备，以分离纯化目的蛋白。设定如下培养条件：30μmol/L ZnCl<,2>、2％葡萄糖LB培养基、1mmol/L IPTG 37℃诱导3-4h或30℃，120rpm诱导过夜，收集菌液。
1.2 利用融合蛋白上的6His能与多种过渡金属螯合物结合及MT能螯合金属离子的特性，采用Zn-Super Chelating Resin亲和层析并采用咪唑和EDTA溶液洗脱结合的融合蛋白，BCA法测定纯化蛋白的含量。
2.蟹重组金属硫蛋白的抗氧化作用及其对长爪沙鼠脑缺血再灌注损伤的的保护作用
2.1 将纯化后的融合蛋白按3mg/kg体重的剂量通过耳缘静脉注射新西兰兔，于注射前、6h、24h、2d、3d、5d和7d取其血液测定血清中的GSH、MDA含量及GSH-Px、SOD、T-AOC活性。
2.2将50-70g普通级沙鼠随机分为假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(IR组)、MT预处理组(MT组)和依达拉奉阳性对照组(ED组)，MT组按2.8mg/kg体重的剂量和ED组按3mg/kg体重的剂量静脉给药30min后行脑缺血15min，IR组颈静脉给予等量生理盐水30min后行脑缺血15min， Sham组手术暴露双侧颈总动脉而不结扎，分别再灌注2d、3d、5d和7d后测血清中的GSH和MDA含量及GSH-Px、T-AOC、SOD活力。
2.3 观察指标
2.3.1 检测血清中的GSH、MDA含量及GSH-Px、SOD、T-AOC活性2.3．2 TTC染色观察脑组织变化。
2.3.3 HE染色观察脑组织的病理变化.
2.3.4 免疫组化观察神经元细胞的凋亡.
结论:
1.优化的诱导条件可表达大量的融合蛋白，并通过亲和层析获得高纯度的无有害内源毒素的金属硫蛋白，用于下一步的功能研究。
2.体内动物实验证明MT在一定的时间窗内可提高动物体内的抗氧化能力。
3.体内动物实验证明脑缺血再灌注可导致神经元坏死，加重脑组织的损伤，MT在一定的时间窗内可提高体内抗氧化酶活力，但在缺血再灌注的早期对GSH含量的作用不明显，需进一步的实验证明。
4.实验证明脑缺血再灌注损伤存在细胞凋亡，MT可减轻细胞凋亡的发生。