Notch信号通路是细胞与细胞之间交流的重要信号通路,于1919年首次发现,由于该基因的缺失会导致黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）翅膀边缘出现缺口（notch）而得名。Notch受体在不同物种以及同一物种的不同受体之间高度保守。截至目前,在斑马鱼中已发现4个Notch受体,分别是Notch1a、Notch1b、Notch2和Notch3。Notch信号通路通过细胞之间受体和配体的结合进行信息交流,从而参与调控个体的生长、发育、疾病及免疫。在对实验室前期获得的notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼进行表型观察时发现纯合子幼鱼在受精后13-17天（days post fertilization,dpf）大小左右时存在胚胎致死现象以及5dpf开始出现鱼鳔发育异常,于是对Notch1a和Notch3参与天然免疫应答及影响鱼鳔的发育机制进行研究。为了研究斑马鱼Notch1a和Notch3对天然免疫功能的影响,首先构建斑马鱼NF-κB基因启动子双荧光素酶报告基因表达载体并检测其启动子转录活性,其次构建Toll样受体（TLR）信号通路中衔接分子myd88和traf6真核表达载体,最后在HEK293T细胞系中利用双荧光素酶报告基因系统检测N1a ICD和N3ICD是否通过myd88或traf6途径激发NF-κB家族基因启动子的转录活性。取得以下结果:（1）成功构建了斑马鱼NF-κB家族5个基因启动子报告基因载体。通过双荧光素酶检测系统发现在HEK293T细胞静息状态下,双荧光素酶检测p GL3-rela-Enhancer报告基因质粒的活性是p GL3-Enhancer空载对照组的50-60倍,p GL3-nfκb2-Enhancer报告基因质粒的活性是p GL3-Enhancer空载对照组的7-8倍,p GL3-relb-Enhancer和p GL3-rel-Enhancer实验组活性较对照组活性显著升高2倍,p GL3-nfκb1-Enhancer实验组活性较对照组活性显著性降低,约为对照的0.1倍。利用LPS刺激HEK293T细胞后,发现各组重组质粒的活性均比未刺激时的活性显著升高了2-3倍。（2）成功克隆了斑马鱼p CMV-myd88和p CMV-traf6基因CDS区全长片段,构建了斑马鱼p CMV-myd88和p CMV-traf6基因真核表达载体。过表达斑马鱼myd88基因后,rela、relb和nfκb1的转录活性显著升高,约为对照组的2.5倍;过表达斑马鱼traf6基因后,rela报告基因的转录活性约为对照组的2倍,relb和rel的转录活性约为对照的1.5倍,nfκb1的转录活性显著升高,约为对照的8倍。（3）在HEK293T细胞中过表达斑马鱼N1a ICD后,对myd88或traf6触发的NF-κB家族中rela基因启动子的转录活性无明显影响;而共同转染斑马鱼N1a ICD和myd88或traf6后,显著激活了nfκb1基因启动子的转录活性。在HEK293T细胞中过表达斑马鱼N3ICD后,对myd88触发的NF-κB家族中rela基因启动子的转录活性无明显影响,但显著激活了traf6触发的rela基因启动子的转录活性,其转录活性升高约2倍;同时nfκb1基因启动子的转录活性较过表达myd88时的转录活性升高了4倍,traf6触发的nfκb1基因启动子的转录活性也显著升高了2倍。并且Notch1a可以显著激活nfκb1的转录活性,Notch3可以显著激活rela和nfκb1的转录活性。并发现过表达Notch1a和Notch3胞内段可以显著激活斑马鱼tp53的转录活性。我们的结果说明,斑马鱼的Notch1a和Notch3分子可以通过接头分子myd88和/或traf6来激活NF-κB信号通路,进而影响下游基因如细胞因子等的表达来影响免疫功能。NF-κB转录因子是炎症和免疫反应关键调节剂,同时也与癌症发生密切相关,研究证明NF-κB信号通路可以通过调节免疫反应影响肺癌细胞的生长。我们通过对notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼表型观察发现,突变体斑马鱼鱼鳔发育存在缺陷,即不能充气膨胀。那么,鳔作为哺乳动物肺的同源器官,其发育机制是否受Notch和NF-κB信号通路之间的交叉调控呢?前面的报告基因结果提示我们,Notch1a和Notch3确实可以显著激活rela或nfκb1的转录活性,因此,我们猜测Notch可能会通过对NF-κB信号通路的调控从而影响鱼鳔的发育。为了研究Notch对斑马鱼鱼鳔发育的影响,我们首先通过组织病理切片技术对WT、notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼鱼鳔的早期发育进行观察。利用实时荧光定量PCR技术对不同天数的WT和突变体斑马鱼中鱼鳔发育相关基因的表达量进行检测,并统计了WT和突变体斑马鱼鱼鳔形态即长、宽和面积的差异。关于Notch1a和Notch3对斑马鱼鱼鳔发育的影响,取得以下结果:（1）组织病理切片及H-E染色观察WT、notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼鱼鳔的发育情况。根据组织病理切片染色结果显示,WT斑马鱼鱼鳔发育正常,在4-5 dpf大小时鱼鳔充气膨胀形成充满气体的空腔,notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼均发育异常,即在4-5dpf大小时鱼鳔不能充气膨胀,依然为发育初期扁平的囊状结构,并且在其肠道与鱼鳔组织之间发现了连通导管即鳔管结构。通过对其形态学数据统计发现,WT、notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼鱼鳔的长度几乎相近,而WT鱼鳔的宽度比是notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼鱼鳔的3倍,致使WT鱼鳔面积是突变体斑马鱼鱼鳔面积的3倍。（2）鱼鳔发育主要受Wnt信号通路和Hedgehog（Hh）信号通路调控,通过实时荧光定量PCR实验,首先检测了6dpf大小的WT、notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼中鱼鳔发育相关基因的表达量变化,其中fz2、wnt2、dkk1、lef1、tcf3a、tcf3b和pbx1基因在notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼中的表达量均显著下调;通过对4-6dpf斑马鱼鱼鳔发育相关基因表达量变化检测,发现仅在5dpf大小时notch1a^-/-和notch3^-/-突变体中fz2和wnt2基因的表达量均显著下调。总而言之,本研究利用双荧光素酶报告基因对Notch1a和Notch3分子通过myd88和/或traf6来激活NF-κB信号通路的新发现,有助于今后深入研究Notch信号通路在TLR信号通路中的作用,以及在肿瘤疾病中的分子机制,为潜在的新型治疗手段的发现提供新思路。组织病理切片技术观察到notch1a^-/-和notch3^-/-突变体斑马鱼鱼鳔在发育早期虽具有鳔管结构但不能充气膨胀,由于鱼类的鱼鳔组织是哺乳动物肺的同源器官,故研究notch1a^-/-和notch3^-/-突变体鱼鳔发育异常有助于我们解决人类的一些肺部疾病。