前言卵母细胞成熟受多种途径精密调控，调控信号的变化对于卵母细胞成熟中胚泡（germinal vesicle，GV）期和胚泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）以及胞质分裂后极体释放的有序进行起关键作用。卵母细胞减数分裂的过程伴随细胞极化，中期Ⅰ纺锤体的一端在特定的空间与时间上接触卵母细胞皮质层对诱发下游事件至关重要，如分裂沟的定位、分裂环的形成、胞质分裂和极体释放。此过程需要肌动蛋白细丝，肌球蛋白等细胞骨架物质的参与，但是什么样的信号促使纺锤体精确地迁移到特定的皮质层区域而促发上述事件的发生困扰了生物学家很多年。本研究发现，Cdc42，一种细胞骨架和细胞极化的重要调节物，在减数分裂和卵母细胞成熟过程中有重要的作用。Cdc42首次在Saccharomyces cerevisiae中发现，作为小G蛋白Rho家族一类能结合GTP的蛋白质，在哺乳动物细胞的信号转导系统中发挥着“分子开关”样的重要作用。最初发现Cdc42参与细胞骨架结构的调节，通过对酵母基因组的研究表明，Cdc42在细胞极化，特别是在S．cerevisiae芽位点的建立上发挥关键作用。研究人员发现在哺乳动物细胞中显微注射活化态的Cdc42，诱导伪足的形成。多项研究证明，Cdc42调节细胞迁移，胞内物质运输以及细胞发育。Cdc42通过actin等细胞骨架物质来调节细胞的形态学变化。分子生理学研究已经证明Cdc42与一些formin、Par3/Par6/aPKC细胞极化复合物分子结合，细胞分裂前纺锤体的不对称定位需要formin参与，并且Par3/Par6/aPKC在纺锤体迁移后，不对称地定位在卵母细胞中。是否Cdc42与formin、Par3/Par6/aPKC一起参与细胞的极化分裂过程?有研究表明在酵母中（Saccharomyces cerevisiae），Cdc42和Bnilp共同参与纺锤体的定位。本研究以另一不对称分裂细胞爪蟾卵母细胞减数分裂过程中极体的形成过程为模型，研究是否Cdc42在卵母细胞减数分裂过程中极体形成以及胞质分裂中发挥作用并探讨其在生物进化过程中细胞分裂中可能具有的普遍性。实验材料1、基因克隆相关质粒及蛋白质免疫印迹试验试剂2、荧光标记的相关分子生物学试剂实验方法一、爪蟾卵母细胞的准备及裂解实验前3日将雌性成熟爪蟾皮下注射50IU孕马血清促性腺激素（serumgonadotrophin，PMSG），实验当日断头处死爪蟾，取腹腔两侧卵巢组织，在显微镜下将其撕裂成10～15个卵左右的碎片，以胶原酶（1mg/mL）消化3小时，取大小相似发育成熟Ⅵ期卵母细胞，置于无Ca²⁺1×OR2培养液中，室温震荡培养4h。冷裂解缓冲液（EB缓冲液：20mM pH 7.3 HEPES，80mM磷酸甘油，20mMEGTA，15mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，10μM ATP，150mM NaF，10μg/mL抑（蛋白）酶醛肽，200μM苯甲磺酰氟，25μg/mL苯甲脒）10μL裂解卵母细胞，4℃13000g离心5min，上清液与2×SDS样品缓冲液和β-巯基乙醇混合，-20℃贮存。二、爪蟾卵母细胞MPF激酶活性检测MPF激酶活性测定：1μM孕酮刺激卵母细胞，取不同时间点的卵母细胞进行裂解，8μl卵母细胞上清裂解液加4μl EB缓冲液(含有2μg histone H1、5μCi[³²P]γ-ATP和100μM ATP)，室温反应20min，12μL 2X SDS样品缓冲液终止反应，15％SDS-PAGE电泳，放射自显影观察。三、体外合成Cdc42T17N、GFP-WGBD mRNA将Cdc42T17N、GFP-wGBD质粒用BamH1进行酶切线性化，1.0％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以线性化DNA为模板，合成Cdc42T17N、GFP-wGBD mRNA，-70℃保存备用。四、正常爪蟾卵母细胞胞质分裂过程观察在无Ca²⁺1×OR2培养液中，14nL Alexa-phalloidin（4U/ml）和10nL Rhodamine-tubulin（3mg/ml）共同显微注射爪蟾卵母细胞。注射后8小时，用1μM孕酮20℃条件下刺激卵母细胞，以动物极出现白点来判断卵母细胞是否发生胚泡破裂（germinal yesicle breakdown，GVBD）。GVBD发生90分钟后，采用共聚焦显微镜观察卵母细胞胞质分裂过程，放大倍数40×，扫描间隙2μm，时间间隔72sec，时间延迟摄影法（time-lapse）观察。五、观察爪蟾卵母细胞中染色体变化按GVBD发生时间收集卵母细胞，转移到新鲜配置的1×OR2培养液中。GVBD发生后60min，将单个卵母细胞放置在含有Hoechst染料（1：5000）的溶液中。染色20min后，自动照相荧光显微镜TIME-LAPES法观察此期间Cdc42T17N mRNA注射组及对照组卵母细胞染色体的变化。六、Cdc42T17N mRNA注射组及对照组爪蟾卵母细胞形态学变化14nL Alexa-phalloidin（4U/ml）和10nL Rhodamine-tubulin（3mg/ml）共同显微注射入爪蟾卵母细胞。注射后8小时，用孕酮20℃条件下刺激卵母细胞，GVBD发生90分钟后，TIME-LAPES法观察此期间Cdc42T17N mRNA注射组及对照组卵母细胞收缩环的形成过程。七、Cdc42T17N mRNA注射组及对照组爪蟾卵母细胞质分裂过程中Cdc42活性观察用10nL 0.25mgml GFP-wGBD mRNA和10nL Rhodamine-tubulin（3mg/ml）共同注射爪蟾卵母细胞，室温表达8h后，16℃孕酮溶液孵育过夜，在此条件下，部分卵母细胞经历GVBD，但是还未装配形成MⅠ纺锤体。利用共聚焦显微镜观察Cdc42T17N mRNA注射组及对照组卵母细胞，扫描间隙2μm，时间间隔2min，进行TIME-LAPES实验。八、Cdc42和球形actin在爪蟾卵母细胞胞质分裂中的定位分析收缩环形成观察：14nL Alexa-g-actin（4U/ml）和10nL Rhodamine-tubulin（3mg/ml）共同显微注射爪蟾卵母细胞。用孕酮室温条件下刺激卵母细胞，GVBD发生90分钟后，TIME-LAPSE法观察此期间卵母细胞收缩环形成。共定位观察：10nL GFP-wGBD mRNA（0.25mg/ml）和14nL Alexa-g-actin（4U/ml）共同注射爪蟾卵母细胞，方法同Cdc42活性观察。九、统计学分析比较正常卵母细胞、Cdc42T17N mRNA注射组的卵母细胞胞质分裂和极体形成百分率，采用SPSS11.5统计学软件进行统计分析，P<0.05认为有统计学意义。结果一、爪蟾卵母细胞MPF激酶活性MPF在孕酮刺激后2h GV期处于失活状态，3h时活性增强，GVBD后，MPF活性又处于较低水平。二、正常爪蟾卵母细胞胞质分裂过程观察Alexa-phalloidin和Rhodamine-tubuIin共同显微注射爪蟾卵母细胞，时间延迟摄影法实时观察发现：随卵母细胞成熟进程，在纺锤体（spindle）一端与卵母细胞皮质层接触后，纤维型actin（F-actin）逐渐聚集在纺锤体上方和周边，形成收缩环（contractile ring），收缩环逐渐向内向下移动，切断纺锤体，形成极体（polar body），胞质分裂完成。三、荧光显微镜观察DNA染色结果卵母细胞GVBD 60min后以Hoechst染料对DNA染色后TIME-LAPSE实验可见：对照组卵母细胞形成极体：Cdc42T17N mRNA注射组未见极体形成。四、Cdc42T17N mRNA注射组爪蟾卵母细胞形态学变化标记Alexa-phalloidin和Rhodamine-tubulin显微注射入爪蟾卵母细胞。通过time-lapse实验发现：对照组卵母细胞中，随着卵母细胞成熟分裂进行，F-actin逐渐聚集于纺锤体的上方并形成收缩环（contractile ring），并最终切断纺锤体形成极体；Cdc42T17N mRNA注射组见少量F-actin聚集，可见纺锤体拉长又再解聚，未见收缩环和极体形成，未见胞质分裂发生。五、Cdc42T17N mRNA注射组及对照组爪蟾卵母细胞胞质分裂过程中Cdc42活性观察GFP-wGBD探针可观察卵母细胞内Cdc42活性变化。在GV和GVBD发生后，未观察到Cdc42活性出现。在极体释放的数分钟前，纺锤体的微管上方可见微弱的Cdc42活性，2～4min内，活性逐渐增强，随后细胞分裂收缩环形成，胞质分裂发生。活性的Cdc42向下扩展，包绕整个极体。Cdc42T17N mRNA注射组未见明显的Cdc42活性出现，但可见纺锤体的形态发生与对照组相似的变化，最终未形成极体。六、Cdc42和g-actin在爪蟾卵母细胞胞质分裂中的定位分析Alexa-g-actin和Rhodamine-tubulin共同显微注射爪蟾卵母细胞。通过time-lapse实验发现：g-actin逐渐聚集于纺锤体上方并形成收缩环，最终切断纺锤体，极体形成。Alexa-g-actin和GFP-wGBD mRNA共同显微注射后可见在卵母细胞的胞质分裂过程中，Cdc42活性和g-actin存在明显的共同定位现象，在出现的时间上具有一致性。七、统计学分析采用SPSS11.5统计学软件进行统计分析，正常卵母细胞、Cdc42T17N mRNA注射组的卵母细胞胞质分裂和极体形成百分率的差异有统计学意义（P<0.05），Cdc42T17N mRNA注射组的卵母细胞胞质分裂和极体形成百分率与正常对照组卵母细胞相比明显降低。结论1、在爪蟾卵母细胞GV期，MPF处于失活状态，GVBD发生时活性增强，收缩环形成前，MPF活性又处于较低水平。2、与对照组相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母细胞GV和GVBD未见明显形态学变化，孕酮诱导的GVBD也未见明显异常。3、与对照组相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母细胞胞质分裂和极体形成受到抑制。4、与对照组相比，注射了Cdc42T17N mRNA的爪蟾卵母细胞染色体的复制、分离并未受到影响。5、Cdc42活性和g-actin存在明显的共同定位现象，在出现的时间上具有一致性。