论文部分内容阅读
L-高丝氨酸内酯是一种重要的非天然手性α-氨基酸内酯,它是一种重要的化工原料和医药中间体,广泛应用于手性药物的合成。本论文的主要目标在于研究利用微生物酯水解酶拆分制备L-高丝氨酸内酯及衍生物,应用于L-硒代蛋氨酸的合成。首先,本论文以N-Boc-DL-高丝氨酸内酯为底物从土壤中筛选到130株对N-Boc-高丝氨酸内酯有选择性水解活力的菌株,其中大多数为(R)-构型酯水解酶产生菌,少数为(5)-构型酯水解酶产生菌,实验筛选获得一株立体选择性较高的(R)-构型酯水解酶产生菌株作为深入研究的目标菌株,通过形态学观察和16SrDNA序列分析,确定其为嗜烟节杆菌,将其命名为Arthrobacter nicotinovorans WYG0001。接着,通过单因素实验,对菌株Arthrobacter nicotinovorans WYG001的发酵及产酶条件进行了较为详细的研究,最后确定该菌株的最佳培养基成分为:酵母膏1.2%,乳糖1.0%,硫酸镁2 mmol/L,磷酸二氢钾1mmol/L,氯化钠1.0%,培养基初始pH为7.0;121℃灭菌20min;菌株的最佳培养条件是30℃,200rmp于30L发酵罐中培养24h。发酵生物量从最初的2.06g/L提高到了 8.55g/L,是优化前的4倍;所得的菌体的酶活力从3.48 U/L提高到75.55 U/L,是优化前的22倍,底物N-Boc-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s也从最初的7.67%提高到82.98%,转化率C由最初的4.9%提高到47.9%。然后,对全细胞催化剂Arthrobacter nicotinovorans WYG001水解动力学拆分N-Boc-DL-高丝氨酸内酯的反应条件进行了详细的研究,最终确定其最优反应条件为:以DMSO(底物/DMSO=1:2,w/v)作助溶剂,在0.1 M,pH 7.2的磷酸钾缓冲液中,底物与菌粉的比为1:2(底物浓度为 2.5%(125 mmol/L),全细胞催化剂Arthrobacter nicotinovorans WYG001 的浓度为 5%(0.05 g/mL)),反应温度为 30℃,200 rpm 水浴反应11h,可获得光学纯的N-Boc-L-高丝氨酸内酯(e.e.s>99.9%),转化率C为51.09%,得率达到48.39%,对映体选择率E值为278。Arthrobacter nicotinoorans WYG001冻干菌粉在重复使用8次后,其催化活性仍保持初始活性的85%。最后,本论文将动力学拆分反应体系放大到200 mL,11 h后反应完全,通过对反应液的分离纯化,最后得到光学纯的N-Boc-L-高丝氨酸内酯2.4 g,产率为48%。经手性气相色谱分析确定其对映体过量值(e.e.s)在99%以上;然后,以微生物酶法选择性催化水解制备得到的光学纯的N-Boc-L-高丝氨酸内酯为起始底物,通过两或三步化学反应成功合成得到了光学纯的L-硒代蛋氨酸,并对L-硒代蛋氨酸进行结构鉴定。