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目的:
克隆NK4基因，构建其重组真核表达载体，转染Raji细胞，观察NK4基因在Raji细胞的表达，为研究NK4的生物学效应和淋巴瘤的基因治疗作相关基础工作。
方法:
1.NK4基因的克隆与重组克隆载体的构建及鉴定
由新鲜人肝组织提取总RNA，行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获NK4基因cDNA，与载体pMD19-T Simple连接，构建重组克隆载体pMD19-T simple-NK4。将重组克隆载体以CaCl2法转化E.Coli DH5α并行氨苄青霉素和α-筛选，采用菌落直接PCR、MuⅠ和SalⅠ双酶切及序列分析等方法，证实目的片段的存在和序列正确。
2.重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4的构建与鉴定
将转化重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4的E.Coli DH5α增菌后，提取重组载体行MluⅠ和SaⅠ双酶切，电泳胶回收目的片段并测定浓度，与经相同双酶切的载体pVITRO2-mcs提取物连接成重组表达载体pVITRO2-mcs-NK4。将重组表达载体转化到E.Coli DH5α并行潮霉素B(100μg/ml)筛选，经菌落PCR、MluⅠ和SalⅠ双酶切等方法确定目标片段的存在。
3.细胞培养条件及筛选用潮霉素B浓度的确定
在维持底层胶琼脂糖浓度为0.5％的基础上，对上层胶琼脂糖浓度(0.1％～0.5％)和细胞浓度(100个/孔～5000个/孔)进行选择，改良琼脂糖半固体培养体系。取对数生长期的Raji细胞，以终浓度为1×105个/ml分别接种于含10～200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培养液(含10％新生牛血清)，于37℃、5％CO2静置培养，以在10～14天致全部Raji细胞死亡的最低潮霉素B浓度作为筛选用浓度。
4.细胞转染与阳性克隆的鉴定
采用脂质体转染法行重组表达载体的转染。37℃、5％CO2静置培养24h后，用50μg/ml潮霉素B进行筛选。以仅加脂质体Raji细胞为空白对照，载体pVITRO2-mcs转染后Raji细胞为阴性对照。取筛选后存活组细胞提取总RNA，行RT-PCR，电泳，检测NK4基因的存在以确定成功转染。
5.NK4基因转染后mRNA表达水平的检测
取第1、7、15代NK4基因转染后Raji细胞培养物提取总RNA，RT后采用实时荧光定量PCR，检测NK4 mRNA的表达水平并评价其表达稳定性，以未转染Raji细胞和载体pVITRO2-mcs转染组为对照。
6.NK4基因转染后蛋白表达的检测
取处对数生长期的NK4基因转染后Raji细胞，采用Western blot、细胞免疫化学法定性检测NK4蛋白的表达。此外，分别收集第1、7、15代NK4基因转染后Raji细胞培养物上清液，采用ELISA法定量检测NK4蛋白的表达，并评价NK4蛋白表达的稳定性。以未转染Raji细胞组、载体pVITRO2-mcs转染组作为对照。
7.NK4基因转染对Raji细胞的生物学性状的影响
取NK4基因转染Raji细胞分别做半固体克隆培养、穿刺培养和单层细胞培养，置37℃、50％CO2静置培养。第3天起每天观察细胞的生长情况至14天，观察集落形成情况，分别评价NK4基因转染对Raji细胞的增殖、侵袭和迁徙的影响。
结果:
1.NK4基因的克隆、重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4的构建与鉴定
新鲜人肝组织提取总RNA后行RT-PCR，可见一约1.4 kb的特异性条带，与目的片段大小一致(1449 bp)，提示NK4 cDNA片段成功扩增。将pMD19-TSimple-NK4转染E.Coli DH5α，筛选出阳性菌落。将阳性菌落PCR产物、重组克隆载体SalⅠ、MluⅠ双酶切产物和未酶切重组载体等同时电泳，可见与目的片段大小一致的特异性条带(1449 bp)，测序结果与Genebank报道的序列相同，提示pMD19-T Simple-NK4成功构建。
2.重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4的构建与鉴定
将重组表达载体pVITRO2-mcs-NK4转染E.Coli DH5α后采用潮霉素B筛选出阳性菌落。将NK4基因的RT-PCR产物、阳性菌落PCR产物、重组表达载体SalⅠ和MiuⅠ双酶切产物、未酶切重组载体等同时电泳，发现与目的片段大小一致的特异性条带(1449 bp)，提示pVITRO2-mcs-NK4获成功构建。
3.最佳细胞培养条件与筛选用潮霉素B浓度的确定
筛选后确定上层胶琼脂糖浓度为0.3％、细胞浓度为1000个/孔，0.5％底层琼脂建立半固体培养体系。在常规静置培养条件(含10％新生牛血清的RPMI1640，37℃、5％CO2)下，分别在10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml潮霉素B的作用下，10μg/ml、25μg/ml组细胞在10～14天后均有存活细胞，而其他4组均死亡，故以50μg/ml潮霉素B作为转染后细胞的筛选浓度。
4.转染后阳性细胞的筛选与鉴定
经50μg/ml潮霉素B处理6天后各组细胞均出现大量细胞死亡。至14天空白对照组均死亡，阴性对照和实验组仍存活，4周后存活细胞明显增加。取常规培养Raji细胞、阴性对照和实验组的细胞提取总RNA，行RT-PCR。扩增产物经电泳发现实验组存在特异性条带(1449 bp)，而常规培养Raji细胞、阴性对照均无，提示重组表达载体pVITRO2-mcs-NK4已成功转染，且对照组均无NK4 mRNA表达。
5.转染后NK4基因表达的检测
采用实时荧光定量PCR检测第1、7、15代培养物NK4 mRNA的水平，结果发现：第1、7、15代pVITRO2-mcs-NK4转染组培养物NK4 mRNA分别为6.68±0.32、6.37±0.29和6.53±0.24，但无显著性差异(P>0.05)，而对照组呈极弱表达，提示NK4基因转染后能在Raji细胞中能稳定表达。
6.转染后NK4蛋白表达的检测
Western blot结果表明，NK4基因转染后Raji细胞的培养液存在大小约50 kDa的蛋白条带，而对照组均无；免疫细胞组化结果显示，NK4基因转染后Raji细胞的细胞浆呈蓝色且有明显的蓝色颗粒，而未转染Raji细胞组和载体pVITRO2-mcs转染组均未蓝染。ELISA检测第1、7、15代NK4基因转染后Raji细胞培养液上清中NK4蛋白量分别为4.14±0.19 ng/ml、4.32±0.27 ng/ml、4.37±0.38 ng/ml，提示各代培养物均有NK4蛋白的表达，且无显著性差异(P>0.05)，说明NK4基因转染后能在Raji细胞中能稳定表达NK4蛋白。
7.NK4基因转染后对Raji细胞的生物学作用
细胞培养试验表明，37℃、5％CO2半固体培养至14天发现：在常规克隆培养中，对照组形成的克隆边缘不齐，有细胞向外生长，而NK4基因转染细胞形成的克隆边缘整齐，偶见向外生长的细胞；经穿刺培养发现各组均有条索状细胞团形成，与对照组相比，实验组细胞团较小，边缘较整齐，周围散在性细胞少；而单层培养结果更为直观，实验组形成边缘整齐的圆形细胞团，提示NK4基因转染抑制了Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。
结论:
NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4。转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞中可稳定表达NK4 mRNA和蛋白，且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。上述结果将有助于深入研究NK4的生物学效应及对淋巴瘤进行基因治疗的探索。