论文部分内容阅读
目的:经前烦躁障碍症(Premenstrual Dysphoric Disorder,PMDD)属传统中医学中的月经前后诸症范畴,时至今日,其深层病理机制仍然有待深入研究。治疗该症的现代化合类药物副作用大、未区分亚型故疗效欠佳,因此寻找替代疗法迫在眉睫。柴胡-白芍药对在中医临床上被广泛应用于治疗肝气郁结,虽PMDD肝气郁证是PMDD的重要亚型,但却鲜见二药治疗PMDD肝气郁证的报道。故本研究拟在检索肝主疏泄理论及实验文献的基础上,制备PMDD肝气郁病证结合动物模型并探查柴胡皂苷与芍药苷配伍(下文中简称柴芍皂苷)治疗该证的作用。通过检测模型大鼠关键生物指标变化以及海马脑区蛋白质组学,以期发现PMDD肝气郁证发病及柴芍皂苷干预的生物标记物,进而揭示肝疏泄不及的深层发病机制并促进治疗药物的研发。方法:(1)通过知网中国期刊全文数据库、万方数据库及PubMed数据库对柴胡皂苷、芍药苷的药理作用及经前烦躁障碍症、肝主疏泄等关键词进行文献检索及理论研究;(2)首先利用强迫游泳实验(Forced Swimming Test,FST)、悬尾实验(Tail Suspension Test,TST)对柴芍皂苷进行基于治疗抑郁样情绪小鼠的效果评价。(3)结合阴道电阻检测动情周期方法,利用强迫游泳应激筛选制备出PMDD肝气郁证大鼠模型,利用FST、高架十字迷宫实验(Elevated Plus-Maze,EPM)、洒水实验(Splash Test)对模型大鼠进行行为学评价。(4)对符合PMDD肝气郁证大鼠模型标准的大鼠予以三个剂量的柴芍皂苷及氟西汀干预,干预结束后再次对实验大鼠进行上述行为学评价,验证柴芍皂苷治疗PMDD肝气郁证的效果。(5)利用ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测模型大鼠外周血、下丘脑、海马中的P、ALLO、E2等生物学指标,并进行各组间的含量变化对比。(6)应用TMT相对定量蛋白质组学技术对PMDD肝气郁证模型大鼠海马脑区进行研究,样品经Q Exactiv eTM HF-X质谱仪在数据依赖采集模式下检测。串联质谱图经过PEAKS Studio version X(Bioinformatics Solutions Inc,Waterloo,Canada)分析后,通过GO分析、KEGG分析结果探讨PMDD肝气郁证模型大鼠海马脑区蛋白表达变化。结果:(1)小鼠药效研究部分:通过小鼠FST以及TST实验发现,各给药组对比空白对照组都出现了较为明显的变化。氟西汀给药组对比空白对照组其悬浮不动时间在三次实验中都呈降低趋势,且第二次实验显示其悬浮不动时间显著降低(P<0.05,P<0.01)。柴芍皂苷高剂量组对比空白对照组其悬浮不动时间在三次实验中也都显示出了相同的降低趋势,且第二次实验与第三次实验都显示其相对空白对照组出现了显著降低(P<0.05,P<0.01),柴芍皂苷低剂量组对比空白对照组其悬浮不动时间出现了降低趋势,三次实验中第二次实验中的两组对比存在显著性差异(P<0.01)。(2)通过强迫游泳实验结合动情周期规律性检测,成功制备出了符合PMDD肝气郁证临床表现规范的大鼠模型,即模型大鼠具有规律的动情周期与“经前出现症状,经后症状消失”的特点,模型大鼠非接受期悬浮不动时间与接受期悬浮不动时间存在显著性差异(P<0.05,P<0.01),高架十字迷宫实验结果与洒水实验结果都辅证了利用FST制备PMDD肝气郁证模型具有较好的效度。而给予模型组大鼠柴芍皂苷及氟西汀治疗后,其悬浮不动时间、悬浮不动次数以及洒水实验中的修饰时间等都出现了明显的改变。(3)ELISA结果提示PMDD肝气郁证模型大鼠的抑郁状态与ALLO、P、E2在外周血清及海马脑区内的含量改变存在高度相关,ALLO含量受P的下降影响而显著减少,模型组大鼠血清中E2含量的降低可能是PMDD肝气郁证的发病机制之一。柴芍皂苷能够通过升高血清内的ALLO、P、E2含量以及海马脑区中ALLO含量,下丘脑中P含量以改善PMDD肝气郁证症状。(4)蛋白质组学结果显示,与模型组相比,正常对照组共发现70个差异蛋白,柴芍皂苷低剂量组共发现260个差异蛋白,氟西汀给药组共发现189个差异蛋白。与正常对照组相比,柴芍皂苷给药组共发现277个差异蛋白,氟西汀给药组共发现228个差异蛋白。对模型组、柴芍皂苷给药组及正常对照组的差异蛋白取交集后发现,模型组下调、柴芍皂苷给药组上调且功能明确的差异表达蛋白有Edem3、Xk、Rraga、Kcnma1、Thsd7b;而模型组上调、柴芍皂苷给药组下调且功能明确的差异表达蛋白有Eipr1、Prkaca、Hba-a3、Ywhah。结论:(1)中医学认为本病病位主要在肝且病性虚实夹杂,故治疗多从肝论治且归病因于肝失疏泄,利用含柴胡—白芍药对治疗肝疏泄不及所致肝气郁结一证的经典方剂在临床上被广泛应用,故采用柴芍二药组分治疗PMDD肝气郁证有着很高的研究价值。本研究中小鼠行为学测试表明柴芍皂苷干小鼠抑郁样情绪有明显的改善作用,而大鼠实验表明柴芍皂苷对于PMDD肝气郁证大鼠模型同样有着良好的治疗效果。(2)PMDD肝气郁证大鼠模型的发病机制与外周血及部分脑区孕酮、四氢孕酮、雌二醇的含量改变存在密切关联,柴芍皂苷可以通过上调上述激素含量改变起到治疗作用。(3)蛋白质组学结果提示,PMDD肝气郁证发病机制可能与Prkaca、Kcnma1以及Ywhah等蛋白表达相关,其中Kcnma1蛋白的下调提示钙离子通道激活调控、Prkaca蛋白的上调提示cAMP信号通路调控,Ywhah蛋白上调提示磷酸丝氨酸结合蛋白介导信号传导。而柴芍皂苷可以通过多途径、多靶点的治疗效应逆转上述蛋白表达,因此我们推测PMDD肝气郁证的发病机制可能与海马脑区中Ywhah及Prkaca等蛋白的表达相关,而将上述蛋白作为PMDD肝气郁证的诊断生物标志物及柴芍皂苷的治疗靶点值得进一步深入验证与探索。