目的:体外溶栓试验是检测溶栓剂溶栓效率的重要手段。多种因素影响溶栓效率,其中血栓的成分是重要因素之一,即溶栓效率随着血栓中交联纤维蛋白含量的增加而降低,随着红细胞含量的增加而增加,二者中血栓交联纤维蛋白含量的影响更重要。在既往报道中,用于溶栓实验的血栓多为人或动物全血体外自然凝固形成,由大量的红细胞和稀疏的交联纤维蛋白网构成,松软易碎,在生理盐水中浸泡数小时即可溶解,或被溶栓剂降解的时间过短,不利于对其效率的检测,并可能是溶栓剂在临床上的实际效率低于在实验条件下的原因之一。近年来,一些学者发现,在体外血栓制作中应用凝血酶,能增强血栓的韧性,延长血栓的降解时间,从而克服上述缺点。可能的机理是,凝血酶的应用使血栓的交联纤维蛋白含量增加,但尚无直接证据。另外,目前应用凝血酶的报道较少,且所加浓度不一,有必要探索一个最佳浓度,使血栓的制作规范化,提高体外溶栓效率检测的可行性和的可比性。本实验观察体外血栓制作时凝血酶的应用浓度对血栓溶解性的影响,及其机制是否在于改变血栓中的交联纤维蛋白含量;在此基础上,对血浆纤维蛋白原水平与血栓中交联纤维蛋白含量进行相关分析,探讨根据血浆纤维蛋白原水平预测血栓溶解性的价值。另外,本研究首次提出一种精确测定血栓中交联纤维蛋白含量的方法,可望在血栓学领域获得认可与应用。方法:1.抽取红细胞比容40%-50%的健康人新鲜静脉血10ml,将每人的血标本用注射器平分为5份;取其中4份,3份分别加入高(75U/mL)、中(50U/mL)、低浓度(25U/mL)凝血酶,1份加入生理盐水作为对照,摇匀,置于37℃水浴箱中3小时,使其凝固形成血栓。2.剩余的1份血标本,应用Clauss法检测人血纤维蛋白原水平。3.将血栓从注射器中取出,观察四组血栓之间机械性能的差别,包括弹性和塑性。4.每个血栓分别切取一部分,修剪成重量为150mg的正方体,磷酸缓冲液冲洗后,置于纤溶酶溶液中,在37℃水浴箱中孵育振荡,肉眼观察血栓降解过程。5.记录血栓降解时间(包括血栓块消失时间和交联纤维蛋白絮状物消失时间),离心,取上清液,保存于-20℃。6.解冻上清液,用蒸馏水稀释,应用酶联免疫法检测D-d二聚体浓度。7.根据D-d二聚体浓度计算血栓中交联纤维蛋白含量。8.对4组血栓交联纤维蛋白含量进行方差分析并两两比较,对4组血栓降解时间进行秩和检验并两两比较,对血纤维蛋白原水平与高凝血酶组血栓中的交联纤维蛋白含量进行相关分析。结果:无凝血酶组血栓韧性差,易碎;应用凝血酶的3组血栓均具有良好的韧性。与无凝血酶组相比,高、中、低浓度凝血酶组血栓的降解时间和交联纤维蛋白含量均显著增加(P均<0.01);高、中浓度凝血酶组与低浓度凝血酶组相比,血栓的降解时间和交联纤维蛋白含量均显著增加(P均<0.01);高浓度凝血酶组与中浓度凝血酶组之间相比,血栓降解时间和纤维蛋白含量差异无统计学意义(P均>0.05)。血浆纤维蛋白原水平与高浓度凝血酶组血栓的交联纤维蛋白含量呈直线相关(r=0.825,P<0.001)。结论:在体外溶栓实验中,应用凝血酶能通过增加血栓的韧性和交联纤维蛋白含量延长血栓降解时间,为实验提供有利条件;在制作血栓时,凝血酶浓度的适宜范围为25U/mL~50U/mL,高于此浓度不能使血栓的韧性和降解时间进一步增加。血浆纤维蛋白原浓度越高,形成的血栓所含交联纤维蛋白含量越多,因此,血浆纤维蛋白原水平可作为预测血栓溶解性的指标。本实验首次提出的根据血栓降解液中D-d二聚体浓度测定血栓中交联纤维蛋白含量的方法,可能具有广泛的应用价值。