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背景与目的脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy,SMA）是一种常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病,可导致儿童肌肉萎缩、呼吸衰竭甚至死亡。致病基因运动神经元生存1（survival motor neuron,SMN1）基因位于染色体5q13.2上,其同源的SMN2基因由于第7号外显子第6位碱基改变（C6T）而仅表达有限的全长功能性SMN蛋白。SMA临床表型根据发病年龄和运动功能障碍分为SMA IIV型,SMN2作为SMA患者唯一的SMN蛋白来源基因,与疾病的临床表型严重程度相关。目前,已有可用于治疗SMA的反义寡核苷酸（ASO）药物——诺西那生,该药能有效延长SMA患者寿命,而早期诊断、早期治疗对于改善SMA患者生存质量尤为重要。因此快速诊断SMA及有效、准确分析SMN2拷贝数对早期治疗SMA起重要作用。本研究分为四部分,第一、二部分分别开发可快速、敏感、特异识别SMN纯合缺失及特异性检测SMN1拷贝数的试剂盒,使SMA诊断更便捷,有利于在基层医院的推广与普及。第三部分,我们应用数字PCR（droplet digital PCR,dd PCR）与多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）技术,分析检测SMN拷贝数的可重复性。第四部分,为探讨ASO药物治疗的SMA小鼠雌雄寿命差异的影响因素,我们对SMA小鼠及FVB小鼠（SMA小鼠构建模型）的寿命做了初步探讨。方法1.随机选取1997年1月至2019年12就诊于福建医科大学附属第一医院的95个SMA样本、89个正常样本,结合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism,PCR-RFLP）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术分析SMN1和SMN2纯合缺失情况。2.随机选取77个样本,采用荧光短片段多重PCR（multiple quantitative fluorescent polymerase chain reaction,QF-PCR）技术检测SMN1基因拷贝数,并用MLPA技术验证。3.应用dd PCR和MLPA技术分析21个SMA患者的SMN拷贝数,并比较两种方法的可重复性。4.以野生型C57BL/6小鼠为对照,研究野生型FVB雌雄鼠不同年龄阶段（新生期、青春期前、青春期、老年期）的不同组织（肌肉、大脑、心脏）中寿命相关基因IGF-1R表达水平差异。结果1.LAMP检测SMN1纯合缺失的敏感性为100%（95%CI 95~100）,特异性为100%（95%CI 95~100）,阳性似然比为∞（95%CI NA∞）,准确性和精确度均为100%,Kappa值为1（95%CI 1~1）;检测SMN2纯合缺失的敏感性为100%（95%CI 52~100）,特异性为99.42%（95%CI 96~100）,阳性似然比为173（95%CI 25~1221）,准确性为99.44%,精确度为85.71%,Kappa值为0.95（95%CI 0.76~1）。2.QF-PCR技术检测SMN1拷贝数的敏感性为95.74%（95%CI 84~99）,特异性为100%（95%CI 86~100）,阴性似然比为0.04（95%CI 0.01~0.17）,准确性为97.40%,精确度为100%,Kappa值为0.95（95%CI 0.87~1）。3.对于MLPA,74.1%（20/27）样本的SMN1拷贝数及29.6%（8/27）样本的SMN2拷贝数检测结果具有可重复性,而dd PCR分析结果均具有可重复性100%（27/27）。4.存在SMN1c.844 C>T突变的样本中,dd PCR与MLPA分析SMN1拷贝数结果不一致,而MLPA结果为正确的SMN1拷贝数。5.未经ASO-11-27治疗的重型SMA鼠平均寿命仅为11天,经ASO-11-27治疗的雌鼠平均寿命延长至256天、雄鼠平均寿命延长至147天,寿命延长存在统计学差异。去势SMA雄鼠睾酮明显降低,存在统计学差异,去势SMA雌鼠雌二醇未发生明显改变。SMA小鼠模型经寿命监测,雌鼠手术组和假手术组寿命无明显统计学差异,雄鼠手术组和假手术组比寿命明显延长,存在统计学差异。SMA小鼠构建模型:FVB雌鼠组平均寿命721天,雄鼠假手术组平均寿命458天,雄鼠手术组平均寿命642天,雌鼠组、雄鼠假手术雄组、雄鼠手术组间寿命存在统计学差异;对照组C57BL/6雌鼠组、雄鼠假手术雄组、雄鼠手术组间寿命无明显统计学差异。6.FVB新生期（day3）雌雄鼠肌肉及心脏组织IGF-1R表达存在明显统计学差异,新生雄鼠肌肉组织IGF-1R较雌鼠高表达,心脏组织低表达,而大脑组织雌雄比表达水平相当。FVB青春期前（day15）至青春期（day80）,雄鼠各组织IGF-1R逐渐趋于雄鼠低水平表达状态,且经去势手术的FVB雄鼠各组织IGF-1R水平出现高表达现象,而经去势手术的C57BL/6雄鼠各组织IGF-1R水平出现低表达现象。FVB老年期（day220）,雄鼠与雌鼠各组织IGF-1R表达水平肌肉组织雄鼠高表达,心脏组织雄鼠低表达,大脑组织表达水平相当。结论1.LAMP可以快速、敏感、特异地区分SMN1、SMN2纯合缺失和非纯合缺失,可辅助临床医师诊断,适用于大规模推广。2.QF-PCR利用三对内参基因引物与SMN1基因比较,仅需进行PCR反应以及片段分析,即可快速、精确检测SMN1拷贝数。3.dd PCR在SMN拷贝数评估方面优于MLPA,为分析SMA基因型和表型相关性提供了可靠的技术手段。此外,SMN1复合杂合突变的SMN1拷贝数评估应采用多种方法联合检测,综合考虑临床表型、遗传模式等方面,才能提高SMA基因诊断的准确率。4.野生型FVB雄鼠受雄激素影响致其平均寿命较雌鼠短,且雄激素水平受寿命相关基因IGF-1R调控。