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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科的α-疱疹病毒亚科,其宿主范围很广,能有效感染多种哺乳动物和一些禽类,引起伪狂犬病,但不感染人和高级灵长类,猪是其自然宿主。伪狂犬病是危害全球养猪业的主要传染病之一,如何预防和治疗伪狂犬病是研究伪狂犬病病毒的首要目的；此外,伪狂犬病病毒还被作为研究疱疹病毒生物学的模式系统,分析病毒的入侵、病毒粒子的包装和胞外分泌以及神经入侵等机制,PRV还作为“活”的追踪剂,被用于各种神经通路的研究。PRV为双链DNA病毒,基因组约为150 kb,在非必需基因区能容纳大的外源DNA片段插入；此外,该病毒还具有高效感染神经细胞并在神经细胞中潜伏的能力,因此PRV适合作为疫苗和基因治疗载体。作为载体,PRV在疫苗生产、基因和肿瘤治疗等方面已有一些成功的尝试,但是,利用哺乳动物细胞内同源重组的方法构建重组PRV病毒是一项繁琐的工作,疱疹病毒基因组BAC克隆的出现极大地简化了重组PRV病毒的构建方法,为发展高效的重组疱疹病毒载体构建技术奠定了基础。本研究以PRV-BAC载体pBecker2为基础,建立了利用交配辅助遗传整合克隆(MAGIC)技术构建重组PRV病毒载体和不依赖转染的、利用大肠杆菌感染介导的PRV-BAC DNA转入动物细胞获得重组病毒粒子的方法,具体研究内容如下：1.表达限制性内切酶Ⅰ-SceⅠ的大肠杆菌DH10B-IS2的构建构建打靶质粒pML294C,将pML294C中约6 kb的umuC:araC-ParaBAD-Ⅰ-SceⅠ-FRT-npt-FRT片段酶切下来,电转化已诱导Red-gam重组酶表达的大肠杆菌DH10B(pML300)。经细胞内同源重组得到araC-ParaBAD-Ⅰ-SceⅠ-FRT-npt-FRT插入染色体umuC基因中的重组大肠杆菌DH10B-ISK。将pCP20质粒转化大肠杆菌DH10B-ISK,温度诱导Flp重组酶表达,筛选得到npt基因被敲除的kans大肠杆菌DH10B-IS2,并验证了该菌株表达的Ⅰ-SceⅠ内切酶的功能。2.受体载体pBecker2-KH的构建将kanr基因打靶盒式结构(H1-Ⅰ-SceⅠ-kanr-Ⅰ-SceⅠ-H2)经同源重组插入pBecker2的TK基因中,得到受体载体pBecker2-KH;进一步通过限制性图谱分析、序列分析和Southern印迹分析,证明重组质粒pBecker2-KH的结构是正确的。将pBecker2-KH转染PK-15细胞,获得了有感染能力的PRV病毒vBecker2-KH。3.通过MAGIC方法构建重组伪狂犬病病毒载体将含供体质粒pRTRA的供体菌DH10β和受体菌DH10B-IS2 (pBecker2-KH、pML300)按比例混合,进行接合实验；用添加了Amp(100μg/ml)、Cam(12.5μg/ml)和Ara(0.2% w/v)的LB固体平板培养；用引物F5和Rsv40进行菌落PCR筛选重组克隆。PCR结果表明这些随机挑选的克隆中均含重组质粒pBecker2-red。进一步通过限制性图谱分析、序列分析和Southern印迹分析,证明重组质粒pBecker2-red的结构是正确的。将pBecker2-red转染PK-15细胞,产生的细胞蚀斑呈现红色荧光；从细胞中收获了有感染能力的PRV病毒vBecker2-red。病毒一步生长曲线显示重组病毒vBecker2-red和vBecker2-KH与亲本vBecker2的体外增殖特征一致。将PRRSV的ORF5通过MAGIC方法克隆至PRV BAC载体上,得到重组病毒载体pBecker2-O5,经转染后获得相应的重组病毒vBecker2-O5。Western印迹检测表明融合了His标签的PRRSV ORF5蛋白在PK-15细胞中实现了表达。4. MAGIC方法构建重组伪狂犬病病毒载体的效率分析构建质粒pRThGA,该质粒与pRTRA供体质粒不同的是：在两个同源臂之间仅克隆了gfp表达盒式结构,没有串联Ampr基因作为筛选标记。以pRThGA作为供体质粒,进行接合实验,然后用含Cam和Ara的LB固体平板培养；用引物F5和Rsv40进行菌落PCR,48个克隆中,有43个扩增得到了-1.7 kb的DNA片段,与gfp的表达盒式结构的大小一致,表明这些克隆含有重组质粒pBecker2-gfp;阳性率为89.4±8.5%。将pBecker2-gfp转染PK-15细胞,产生的细胞蚀斑呈现绿色荧光；从细胞中收获了有感染能力的PRV病毒vBecker2-gfp。Western印迹检测表明融合了His标签的绿荧光蛋白在PK-15细胞中实现了表达。5.感染性大肠杆菌转运PRV-BAC进入哺乳动物细胞的能力质粒pGBQinv-hly克隆有Yersinia pseudotuberculosis入侵素基因(inv)和Listeria monocytogenes的李斯特溶菌素LLO基因(hly)。将质粒pGBQinv-hly分别转化大肠杆菌DH10B (pBecker2)、DH10B (pBecker2-KH)和DH10B (pBecker2-red)获得了感染性大肠杆菌DH10B-pBGih1、DH10B-pBGih2和DH10B-pBGih3,用这3株大肠杆菌分别感染PK-15细胞,从中都获得了PRV病毒粒子；病毒滴度分析表明这三株细菌转运BAC DNA的效率相似。感染性大肠杆菌也将重组PRV-BAC载体pBecker2-O5转运至PK-15细胞内,获得了相应的重组病毒。用DH10B-pBGihl分别感染PK-15、IBRS-2、Hela和Vero细胞,前三种细胞均会发生病变,而Vero细胞无病变出现。6.感染性大肠杆菌细胞感染条件的研究其最佳感染条件为：DH10B-pBGih1感染IBRS-2和Hela细胞的最佳时间均是60min,在60-150 min的范围内,被感染细胞中释放的病毒滴度差异不大；而细菌对IBRS-2和Hela细胞最佳的感染剂量分别为900 MOI和600 MOI；在300-3000之间,IBRS-2细胞中释放的PRV病毒量接近,而MOI在600-3000之间时,Hela细胞中释放的PRV病毒滴度也无显著差异。7.感染性大肠杆菌小鼠感染的研究将DH10B-pBGih1按1×109CFU的接种量、通过肌肉或腹腔注射BALB/c鼠,以vBecker2和pBecker2为对照,DH10B-pBGih1感染后,在小鼠的主要器官,如脾脏、肝脏和脑组织的匀浆液中均没有检测到PRV病毒的存在。DH10B-pBGih1免疫小鼠后,也不能诱发小鼠的免疫应答,小鼠不能抵御强毒的攻击,这表明感染性大肠杆菌不能有效的将PRV-BAC DNA转运至小鼠的体细胞中。综上所述,本研究建立了基于PRV-BAC的交配辅助遗传整合克隆系统,使用该系统构建了几种PRV重组病毒载体；还建立了通过大肠杆菌将PRV-BAC基因组DNA直接转运至哺乳动物细胞的技术；这两种技术结合使用,使获得重组病毒的时间缩短至7天,为PRV载体在疫苗生产、基因和肿瘤治疗以及神经通路研究等领域的广泛应用奠定了基础。该方法也适用于构建其他BAC化的疱疹病毒载体以及将BAC DNA有效转运至哺乳动物细胞内,为疱疹病毒的遗传修饰和重组工程研究也提供了技术支撑。