肠激酶（Enterokinase,EK）是存在于哺乳动物十二指肠内的一类丝氨酸蛋白水解酶。先天性缺乏EK的人群会造成严重的肠道吸收不良,并伴有腹泻、呕吐等现象,进而影响到人的生长发育。完整的EK由轻链和重链组成,两者通过一对分子间二硫键结合,单独表达EK的轻链具备生物催化活性,重链起到将轻链锚定在小肠刷状缘膜上的作用。EK特异性识别切割DDDDK序列,催化反应中作用于赖氨酸羧基末端肽键,产生的目标蛋白的N端首个氨基酸与天然蛋白一致,不会引入多余的氨基酸残基。由于EK的这种酶切特点,使EK作为一种工具酶广泛应用于生物医药领域。目前,EK在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达水平较低,难以应用。为提高EK的胞外分泌水平,实现未来的工业化生产。本论文从信号肽的改造入手,采用6种不同的信号肽序列SP1、SP2、SP3、SP4、SP7和SP8,替换掉α-factor信号肽pre-region区域的氨基酸序列,比较了信号肽的改造对P.pastoris GS115分泌表达EK的影响。与α-factor信号肽相比,SP1序列的信号肽显著提高了EK的分泌表达,EK的表达量从6.8mg·L^-1提高至14.3 mg·L^-1,酶活从2390±212 U·m L^-1提高至4995±378 U·mL^-1。在SP1信号肽的基础上,为进一步优化EK在P.pastoris GS115中的分泌表达,本研究又共表达了P.pastoris GS115内源蛋白BiP,PDI和Kex2,其中BiP的共表达对EK的酶活无影响,PDI和Kex2的共表达分别将EK的酶活提高至6178±432 U·mL-1和7219±489 U·m L-1。然而,当PDI和Kex2组合一起同时共表达时,与单独共表达Kex2相比,EK的酶活并未再次提升,酶活只有5616±320 U·m L-1。在EK胞外分泌效率的比较中发现,共表达P.pastoris GS115内源蛋白PDI和Kex2提高了EK比酶活。在融合表达的研究中,本文又在EK的N端融合表达一些蛋白Trx A、DsbA、DsbC和SUMO,并在融合蛋白与目的蛋白间加入GSGSGSDDDDK序列实现EK的自我切割,结果发现N端融合TrxA、DsbA时EK胞外活性显著降低,N端融合DsbC和SUMO时,发酵上清中未检测到EK活性。分析了EK融合蛋白后表面溶剂可及性发现DDDDK序列暴露在蛋白表面并不影响EK的自切割。表明EK的N端序列对活性有重要的影响,可对EK进行N端改造。为探究N端序列对EK活性的影响,进一步优化EK在P.pastoris GS115中的分泌表达,本研究在EK的初始序列前随机引入3个氨基酸组合的短肽,通过48孔板筛选最终得到4株突变体菌株GP1EFM、GP1RNL、GP1LKR和GP1WLR。研究发现,GP1WLR菌株可以显著地提高酶的活性,将EK的酶活从4995±378 U·m L-1提高至15145±920U·mL-1（比酶活为1174600±53100 U·mg-1）。对EK进行底物动力学分析发现,EK的N端引入短肽后,米氏常数Km升高,底物结合能力降低,但在底物催化能力上均有所提高。综上的研究为EK未来的相关应用奠定了基础。