报告指出,美国2010年有191533例前列腺癌新发病例和26329例死亡病例,超过肺癌,居男性肿瘤之首。近年来,我国前列腺癌的发病率明显上升,伴随着人口老龄化,环境变化,体检意识的增强等原因,我国前列腺癌患者必将进一步增加。我国前列腺癌患者必将进一步增加,成为威胁老年男性第一杀手。虽然手术治疗能有效地控制早期局限性前列腺癌,但是许多患者没能重视,很少复查,最终导致复发。尽管临床上常用ADT(androgen deprivation therapy, ADT)作为晚期前列腺癌的姑息性治疗方式。然而,ADT只能延缓肿瘤的进展,最终,多数患者不可避免的会发展到激素非依赖性前列腺癌,而对多种内分泌药物产生耐药甚至抵抗而继续进展,侵犯周围组织及远处转移,继而引起患者的死亡。此外,由于前列腺癌患者年龄大,基础疾病较多,往往因为其他相关疾病引起相应症状而不具备充分的身体素质去耐受细胞毒性药物及化疗药物所带来的副作用。因此,迫切需要深入探讨进展性前列腺癌的发展及转移机制,并评估新的治疗手段对肿瘤免疫方面的效应机制。动物模型是进一步研究前列腺癌的发展、转移机制、肿瘤与宿主免疫效能、评估肿瘤治疗措施有效性的重要工具。目前,国内外关于前列腺癌动物模型的研究甚多,但是这些模型仍不能准确模拟人类前列腺癌发生、发展、侵袭及转移的全过程,存在主要问题是：1)对肿瘤发生发展相关的分子生物学事件尚未阐明；2)缺乏研究肿瘤与宿主相互作用的工具；3)反映人肿瘤分子生物学多样性的模型不足。国内外关于结合肿瘤血清标志物等多途径的观察肿瘤生长、转移情况的研究尚少,且实验小鼠通常是重度免疫功能缺陷的SCID小鼠或者裸鼠,无法分析肿瘤免疫学相关指标。因此,本研究适时地利用了基因工程相关技术,结合血清肿瘤标志物及报告基因系统,构建出一个免疫功能健全的前列腺癌小鼠皮下种植模型,通过对其活体的观察及检测外周血肿瘤标志物的变化情况,评估肿瘤生长的过程,并利用流式细胞学技术探究模型的免疫相关指标的变化情况,为前列腺癌免疫机制的研究和免疫耐受机制的研究提供了很好的工具。目的：结合荧光实时成像和血清学肿瘤标记技术,构建一个可供评价免疫机制及生物学功能的小鼠前列腺癌动物模型。方法：质粒构建：根据GenBank中表达人PSA蛋白的KLK3基因序列(GI:22208990)、Luc基因(GI：13195703)设计聚合酶链反应(PCR)引物,由上海英潍捷基有限公司合成。通过RT-PCR、PCR扩增及酶切连接技术,分别扩增出KLK3基因序列及luc基因序列,并以pIRES元件为模板载体,分别将扩增出luc及KLK3基因连接于pIRES的上游和下游,酶切位点分别为Xho Ⅰ、MluⅠ和Xba Ⅰ、Sal Ⅰ,与相应酶切的PIRES-KLK3质粒连接,构建出Luc-pIRES-KLK3质粒,质粒提取后PCR验证无误,并送公司测序鉴定(北京擎科新业生物技术有限公司)。质粒稳定转染和鉴定：Luc-pIRES-KLK3质粒测序正确后扩大培养,lipo2000稳定转染小鼠前列腺癌细胞株RM-1,采用G418单克隆筛选法得到稳定表达的单克隆株RM1-luc-pIRES-KLK3。大量克隆培养该细胞株,用200ug/ml的G418压力培养基维持一个月稳定培养。荧光定量PCR (qRT-PCR)及Western blot鉴定PSA蛋白的表达：qRT-PCR:提取总RNA,电泳验证其完整性,逆转录完成定量PCR,绘制熔解曲线及扩增曲线,并设置对照组,进行相对表达量的对比；Western blot:标准的Bradford法进行蛋白定量,SDS-PAGE凝胶电泳,分离后的蛋白被转移到PVDF膜上,室温封闭1小时,一抗为抗PSA单克隆抗体(santa crus,1:1000),4度孵育过夜,HRP标记的兔抗鼠IgG作为二抗(santa crus,1:1000)室温封闭1小时后,加入ECL化学发光试剂置于暗盒中用X片胶片曝光检测。体外发光强度检测：取96孔板一块,分为8组,每组7个孔,吸取混合均匀的RM1-luc-pIRES-KLK3细胞2×105个,倍比稀释,每个孔的细胞数减半到第6孔,最后1孔中仅加入RM-1细胞作为空白对照,除单加细胞的孔,其他孔内于荧光显像前10分钟加入荧光素酶底物luciferin100ul,终浓度为150μg/mL。静置3min,然后在IVIS100成像系统上检测发光情况并拍照记录。动物模型的构建：小鼠肿瘤体积大小观察测定及活体荧光成像：取对数生长期RM1-luc-IRES-KLK3细胞,DPBS制成密度为2.0×106个／ml细胞悬液,加入到5mg/ml的基底膜基质中,混匀备用。C57BL/6小鼠均饲养在层流架中,SPF级别,采用10%水合氯醛合剂按300mg/kg剂量腹腔注射麻醉,于小鼠背侧部皮下注射100ul,约2×105个细胞。分别于注射后第1周、第2周、4周、8周时观察小鼠皮下肿瘤生长情况,并游标卡尺记录肿瘤体积大小情况,同时通过IVIS100小动物活体成像系统实时观测小鼠活体荧光强度及有无微转移灶等情况,显像前15分钟按150mg/kg腹腔注射荧光素底物D-luciferin (Perbio Science Nederland)。小鼠外周血PSA测定及外周血免疫学分析：PSA测定采用取眼内眦血法分别取得每只小鼠约0.2ml全血离心后得到约0.1ml血浆将标本置于仪器Achitect i2000中用Total PSA检测试剂对其进行定量分析；另于第7天和第21天的时候,取小鼠眼内眦血液样品分析小鼠外周血中MDSC细胞(CD11b+、 GR-1+)及T调节细胞(CD4+、Foxp3+),随肿瘤生长进展的变化情况。记录小鼠存活时间,于第8周对所有小鼠安乐死,取皮下肿瘤及肝脏、脑、肺等组织进行HE染色、免疫组化检查。结果：成功构建出Luc-pIRES-KLK3质粒,酶切电泳鉴定分析无误,测序公司测序验证KLK3及luc基因的插入。稳定细胞株构建及鉴定：利用G418单克隆筛选法成功筛选出RM1-luc-pIRES-KLK3单克隆细胞株,并用qRT-PCR的方法从基因水平上鉴定该细胞特有的PSA的表达,继而Western blot蛋白水平上检测出PSA蛋白的表达体外荧光成像检测：通过IVIS100成像系统观察该细胞系,确定存在荧光素酶的表达,且表达水平的高低与细胞数量呈正相关。小鼠荷瘤模型：皮下接种2×105个RM1-luc-pIRES-KLK3细胞数,1周后所有小鼠100%可见成瘤,并稳定表达PSA。在细胞接种后的第1、2、4、8周分别检测外周血血清中PSA水平及IVIS动态成像系统中荧光定量分析,结合游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的体积大小情况,结果表明小鼠活体肿瘤的荧光强度和肿瘤体积大小呈正相关(R2=0.937),同样的结果也出现在小鼠活体肿瘤的荧光强度与PSA水平之间(R2=0.988),同时分析表明,肿瘤体积大小与PSA水平呈正相关(R2=0.908)。外周血流式细胞学分析结果表明,随着肿瘤生长,MDSC细胞和Treg细胞数量出现了相应变化,表达CD4+.Foxp3+免疫细胞Treg所占淋巴细胞百分比(7.35%vs.9.62%；p=0.0001)呈上升的趋势,表达CDllb+. Gr-1+的MDSC细胞同样也在增长(1.93%to3.02%,p=0.002)。最终HE染色确认了小鼠皮下肿块为前列腺癌并相关转移瘤。结论：本组实验成功筛选到同时表达PSA和Luc的RM1-luc-IRES-KLK3稳定细胞系,并据此建立了前列腺癌仿生化小鼠模型,为后续及相关实验研究打下坚实的基础,也为研究前列腺癌免疫耐受机制提供了很好的工具。