目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是人类最常见的年龄相关神经系统退行性疾病，是痴呆中最普遍的一种形式。其主要病理学变化包括：β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积形成老年斑（senile plaque, SP）、神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）、突触缺失、神经元变性死亡以及星形胶质细胞过度活化和增生等。星形胶质细胞在AD的发生与发展过程中具有双刃剑的作用，适度激活的星形胶质细胞可胞吞Aβ蛋白，释放神经营养因子，保护神经元，缓解AD的病理进展，但过度激活的星形胶质细胞，通过释放神经毒性的细胞因子和其他毒性物质，促进神经元的凋亡。神经甾体（neurosteroid）是中枢神经系统中甾体类物质及其代谢产物的总称，主要由胶质细胞和神经元合成，在中枢神经系统的功能调节中发挥广泛作用。研究显示，在多种神经退行性疾病中，神经甾体水平发生明显变化，尤其AD患者脑脊液中PROG及AP水平与正常同龄人相比显著下降。本实验室前期的研究发现在AD病理模型中，大鼠神经元的神经甾体合成代谢发生明显变化，但是在AD病理模型下，星形胶质细胞神经甾体的合成代谢，以及神经甾体对星形胶质细胞与神经元交互作用中的影响尚未研究。因此本研究使用β淀粉样蛋白构建AD样细胞模型，检测Aβ活化的星形胶质细胞合成代谢神经甾体的变化，进而确定与其活化关系密切的神经甾体，并阐述神经甾体对Aβ活化胶质细胞的影响，及其在胶质细胞与神经元交互作用中的影响。本研究为神经甾体在AD防治中的应用提供实验依据。方法：1细胞培养1.1大鼠大脑星形胶质细胞原代培养取新生Spague-Dawley（SD）大鼠，无菌条件下取大脑皮质，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15-20min，含10%FBS的高糖Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium（DMEM）终止消化。使用巴氏吸管吹散细胞，制成单细胞悬液，接种于预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中，37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育，每隔2-3d全量更换培养液至细胞基本融合。使用‘二次震荡法’纯化星形胶质细胞，GFAP免疫荧光染色结果显示星形胶质细胞纯度超过95%。纯化后星形胶质细胞经消化、重悬，以1×105个/mL密度接种于孔板中，含10%FBS的DMEM培养。1.2大鼠大脑皮质神经元培养取新生24h内SD大鼠大脑皮质，胰蛋白酶消化辅以机械分离法分离细胞，悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，接种于预先包被多聚赖氨酸的玻片上，在37oC，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育，6h后首次换液为含2%B27的neurobasal培养基，培养48h后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，48h以后完全换液，此后每两天半量换液。取培养6-7d的神经元细胞供实验用。1.3星形胶质细胞与神经元共培养星形胶质细胞与神经元的共培养参照文献方法略有改进，星形胶质细胞培养于处理过的六孔板中，每个孔底部含有4个约2mm高的石蜡小柱，用于支撑载玻片；神经元培养在经多聚赖氨酸处理的载破片上，培养7天后，将载有神经元的玻片放入经不同药物处理的星形胶质细胞进行共培养，更换培养液为DMEM（不含Aβ、PROG），继续培养48h。2实验分组与给药2.1Aβ1-42处理对星形胶质细胞的活化星形胶质细胞经不同浓度的Aβ1-42处理，随机分为Control、AβL（1μM）、AβM（5μM）、AβH（10μM）四组，处理24h，观察星形胶质细胞形态，检测炎症因子的释放。2.2Aβ1-42处理对星形胶质细胞神经甾体水平的影响星形胶质细胞经胆固醇和Aβ1-42处理，随机分为空白组、Control组（胆固醇底物组，胆固醇浓度为10μM）、Aβ组（胆固醇+Aβ1-42，胆固醇和Aβ1-42浓度分别为10μM和5μM），处理24h，检测神经甾体的水平。2.3PROG处理对Aβ1-42活化星形胶质细胞的影响星形胶质细胞分别加入不同浓度PROG（0，0.01μM，0.1μM，1μM）与Aβ1-42（5μM），随机分为Control、Aβ、PL、PM、PH五组，共同处理24h，用于检测炎症因子的释放、NF-κB的活性及与神经元共培养实验。3GFAP标记免疫荧光染色观察星形胶质细胞的形态通过对GFAP（星形胶质细胞特异性中间纤维蛋白）免疫荧光染色，观察星形胶质细胞的形态。各组细胞加药处理后，取出细胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，兔源GFAP（1:1000）4℃孵育过夜，二抗孵育1h，荧光显微镜下观察。4ELISA测定星形胶质细胞条件培养液中炎症因子IL-1β和TNFα的水平取各组细胞培养液，3000rpm离心，取上清，按试剂盒说明书操作，酶标仪读取数值。5HPLC-MS法测定星形胶质细胞神经甾体水平取各组细胞培养液，加入内标甲睾酮，用乙酸乙酯/正己烷萃取，合并有机相，50℃水浴下氮气吹干，60℃水浴中2-硝基-4-三氟甲基苯肼（2NFPH）衍生化40min，采用HPLC-MS技术测定孕烯醇酮（pregnenolone, PREG）、脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）、孕酮（progesterone, PROG）和别孕烯醇酮（allopregnanolone,AP）的含量。6星形胶质细胞中NF-κB活性的检测6.1免疫荧光法通过观察免疫荧光染色的NF-κB主要功能性亚单位p65在细胞中的定位，反应NF-κB的活性。取各处理组星形胶质细胞，4%多聚甲醛固定30min，兔源p65（1:100）4℃孵育过夜，二抗孵育1h，荧光显微镜下观察。6.2Western Blot分析通过Western Blot检测p65在细胞核中的表达，反应NF-κB的活性。取分组加药处理后星形胶质细胞，冰上收集细胞，提取细胞核蛋白，-80℃，备用。等量蛋白提取液与上样缓冲液混合，煮沸变性。样品经SDS-PAGE电泳分离，100mA湿转，脱脂奶粉封闭，加兔源p65（1:1000）孵育过夜，TBS漂洗后加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，ECL光化学法显色，暗室中压X光片显影。X-光胶片经扫描，应用ImageJ图像分析软件对扫描图上的条带进行相对定量分析。7MTT法检测神经元存活率取出神经元细胞爬片，放入24孔板中，每孔加入40μL MTT（5mg·mL-1），于37℃孵育4h，弃去培养基，每孔各加入300μL DMSO，混合均匀，酶标仪测定各组细胞490nm波长处的吸光度（OD值），以各组细胞吸光度与对照组吸光度的比值表示相对细胞存活率。结果：1Aβ1-42对星形胶质细胞形态学的影响GFAP标记的免疫荧光染色，观察星形胶质细胞的形态。荧光显微镜下可见，对照组的星形胶质细胞胞体饱满，扁平，胞浆丰富，Aβ低剂量组胞体有轻微回缩，中剂量组胞体回缩，突起延展，高剂量组细胞突起明显增多，延伸，细长，呈星形放射状。说明Aβ1-42处理后的星形胶质细胞形态发生明显改变。2Aβ1-42对星形胶质细胞炎症因子释放的影响ELISA检测结果显示，与对照组相比，AβM和AβH组细胞培养液中IL-1β水平均显著升高（P<0.05），AβL、AβM和AβH组细胞培养液中TNFα的水平均显著升高（P<0.05）。结果显示Aβ1-42可以促进星形胶质细胞炎症因子的释放。3Aβ1-42对星形胶质细胞神经甾体水平的影响HPLC-MS法检测结果显示，与对照组相比，Aβ1-42处理的星形胶质细胞神经甾体PROG水平下降43.8%，具有统计学显著差异（P<0.05），而PREG和DHEA水平均未见显著变化（P>0.05）。4PROG对活化星形胶质细胞炎症因子释放的影响ELISA检测结果显示，与正常对照组相比，Aβ组星形胶质细胞条件培养液中IL-1β和TNFα释放均显著升高（P<0.01）；与Aβ组相比，PM组、PH组IL-1β和TNFα的释放均显著下降（P<0.05）；PL组IL-1β和TNFα的水平变化无统计学显著差异（P>0.05）。结果显示孕酮能够浓度依赖的抑制Aβ引起的星形胶质细胞炎症因子的释放。5PROG对Aβ1-42活化星形胶质细胞NF-κB活性的影响免疫荧光结果显示，NF-κB的主要功能亚单位p65在正常对照组细胞的胞质明显表达，胞核无着色；Aβ组NF-κB被激活，表现为p65核转位，可见胞核深染，感光强。孕酮和Aβ1-42共同处理24h，随孕酮浓度的增加，p65在细胞核中的分布逐渐减少，胞质中分布增多，孕酮浓度依赖的抑制Aβ1-42引起p65的核转位。Western blot结果显示，与对照组相比，Aβ组星形胶质细胞核提取液中p65的表达显著增加（P<0.01），孕酮处理有效抑制Aβ1-42引起的p65核转位，与Aβ组相比，中、高剂量组细胞核提取液中p65表达量显著降低（P<0.01），低剂量组无统计学差异（P>0.05）。结果表明,孕酮浓度依赖的抑制Aβ1-42活化星形胶质细胞中NF-κB的活性6孕酮抑制Aβ活化星形胶质细胞所致神经元损伤MTT结果显示，Aβ活化星形胶质细胞组大鼠皮质神经元存活率显著下降，为对照组的70.1%（P<0.05）。孕酮抑制Aβ活化星形胶质细胞引起的神经元存活率下降，作用呈浓度依赖性。与Aβ组相比，孕酮中、高剂量组神经元存活率显著升高，分别为Aβ组的115.9%和129.6%（P<0.05）。结论：1Aβ1-42处理浓度依赖的激活星形胶质细胞，表现为：1）胞体回缩、突起伸长，呈星形放射状；2）炎症因子IL-1β和TNFα释放水平升高；3）激活核转录因子NF-κB的活性。2Aβ1-42处理的星形胶质细胞可使其神经甾体孕酮水平显著下降，表明Aβ1-42可影响神经甾体的水平。3孕酮能浓度依赖的抑制Aβ1-42活化星形胶质细胞炎症因子的释放和NF-κB信号通路的激活，说明孕酮可以有效的抑制Aβ1-42对星形胶质细胞的活化。4Aβ1-42活化的星形胶质细胞对神经元具有损伤作用，孕酮浓度依赖的抑制星形胶质细胞活化，保护星形胶质细胞活化所致神经元损伤。