利用病毒诱导的基因沉默技术探讨番茄PG与乙烯关系

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病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)是近年来应用于植物研究中最广泛的RNA沉默技术之一,它采用外源病毒所驱动的同源防卫机制来沉默植物体的单个基因,通过构建携带有植物功能基因cDNA片段的病毒载体并侵染寄主植物体,诱导植物发生基因沉默从而出现目标基因功能丧失或表达水平下降的表型,进而在较短的时间内研究该基因的功能,是一种从反向遗传学方向快速分析、鉴定植物基因功能的技术。本研究以绿熟期的立春番茄为研究对象,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,根据NCBI发表番茄PG基因序列,以野生型番茄cDNA为模板扩增出两端带有酶切位点的PG基因片段,并将其连接到烟草脆裂病毒载体上。将重组病毒载体转化至农杆菌GV3101中后,以真空渗透的方式使用农杆菌侵染番茄离体果实以实现PG基因沉默。通过Real Time PCR等技术从分子和生理两个角度对PG、ACS及乙烯进行测定。同时利用相同方法对番茄ACS2基因进行沉默,抑制番茄乙烯的生成后对番茄PG活性进行测量。从而观察、探讨番茄中PG和乙烯的关系。研究发现,与未处理的样品相比,经过PG、ACS2基因沉默的样品中PG、ACS的表达量和活性均偏低;病毒诱导的PG、ACS2基因沉默对绿熟期离体番茄果实成熟过程中系统II乙烯的合成有明显抑制作用;由于当番茄果实中ACS2基因被沉默时,番茄果实乙烯的生成也受到抑制,由此可以推测,番茄果实中PG与番茄果实ACS2或ACS基因家族及乙烯是相互影响的。针对番茄PG基因被沉默时,ACS2基因的表达受到抑制、番茄ACS2基因被沉默时,PG基因的表达受到抑制的现象,还提出了PG基因和ACS2或ACS基因家族存在共同的控制元件,且该控制元件与两个基因均为控制-反馈模式的猜想。
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