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棉花是一种全球性种植的重要经济作物,其棉纤维在纺织工业及其相关产业中具有十分重要的应用价值。如何增加棉纤维产量、提高棉纤维品质是目前棉花生产过程中面临的重要问题之一。目前大量的研究表明,植物激素(如乙烯等)对棉纤维的生长发育具有十分关键的作用,但有关乙烯等植物激素在棉纤维生长发育中的分子调控机制还不清楚。本实验室在之前的研究中鉴定出一个乙烯应答因子GhERF108,本文主要研究GhERF108是否通过乙烯信号通路调控棉纤维的发育,试图为提高棉纤维产量及品质的分子育种提供一些科学资料。本文取得的主要研究结果如下:1、乙烯促进GhERF108基因表达利用开花后21天(21 DPA)的棉花胚珠及纤维进行体外离体培养,提取用乙烯合成前体ACC和乙烯合成抑制剂AVG处理不同时间后棉纤维的RNA,利用荧光定量qRT-PCR分析GhERF108在激素处理0-120小时后的棉纤维中的表达情况。结果表明,外源施加ACC能够促进GhERF108在棉纤维中的表达,且在诱导96小时后达到最大值,而乙烯合成抑制剂AVG的处理使GhERF108的表达有所下调。这说明GhERF108能够响应乙烯信号,可能参与到乙烯信号通路中。2、GhEIN3激活GhERF108的表达以往的研究表明EIN3作为乙烯应答的关键调控因子参与到乙烯信号通路中。为了研究GhERF108是否也通过GhEIN3途径参与到乙烯信号通路中,构建了融合表达载体 GhEIN3:eGFP、GhERF108-P1:LUC、GhERF108-P2:LUC,转入农杆菌,注射幼嫩的烟草下表皮,在化学发光成像系统下观察荧光情况,并进行酶活检测。结果表明,GhEIN3能够激活GhERF108的表达,说明GhERF108可能参与GhEIN3介导的乙烯信号通路中。3、乙烯促进棉纤维细胞伸长和次生壁合成研究表明GhERF108在棉纤维细胞次生壁增厚期高表达。为了研究乙烯对棉纤维细胞次生壁发育的影响,采取开花当天的棉花胚珠进行体外离体培养。用乙烯处理离体的棉花胚珠,测量相关激素处理后的棉纤维长度,并制作树脂切片,经甲苯胺蓝染色,在显微镜下观察并统计棉纤维细胞壁的厚度。结果表明,外源施加乙烯合成前体ACC能够促进棉纤维细胞伸长和次生壁增厚,而外源施加乙烯合成抑制剂AVG抑制棉纤维细胞伸长和次生壁合成,说明乙烯对棉纤维细胞的发育具有重要作用。4、GhERF108 RNAi及过量表达转基因棉花表型分析为了进一步研究GhERF108在棉纤维发育中的作用,对先前获得的GhERF108 RNAi转基因棉花后代株系进行了相应的表型分析。结果表明T2和T3代GhERF108 RNAi转基因棉花成熟纤维长度短于野生型,棉桃变小。而且,GhERF108 RNAi转基因棉花纤维细胞次生壁薄于野生型,但细胞形态无明显变化。对GhERF108 RNAi转基因棉花纤维细胞次生壁的主要成分进行分析发现,其棉纤维细胞次生壁中的木质素含量无明显变化,而纤维素含量变少,说明GhERF108能够影响棉纤维细胞次生壁的发育。同时,我们还构建了 35S:GhERF108过量表达载体,通过农杆菌侵染棉花下胚轴的棉花转化,获得了转基因棉花植株。对T1代GhERF108过量表达转基因棉花成熟纤维进行分析发现,其棉纤维长度较野生型变长。后续有关GhERF108过量表达转基因棉花纤维细胞次生壁的研究还在进行中。5、GhERF108增强GhARF7-2对GhLBD30和GhMYBL1基因的激活作用为了进一步研究GhERF108影响棉纤维细胞次生壁发育的分子机制,我们利用体内双分子荧光互补实验分析了 GhERF108与多个细胞次生壁发育时期相关的GhARFs蛋白的相互作用关系。结果表明,GhERF108能够与GhARF7-1、GhARF7-2相互作用,与 GhARF5-1、GhARF5-2、GhARF6-1、GhARF6-2、GhARF6-3 无相互作用。体外Pull-down实验也进一步证实了 GhERF108蛋白能够与GhARF7-1、GhARF7-2蛋白相互作用。另外,我们利用转录激活实验分析了 GhERF108、GhARF7-1、GhARF7-2对多个细胞次生壁发育相关的GhLBDs以及GhMYBL1的调控关系。结果表明,GhARF7-2能够直接激活GhLBD30和GhMYBL1的表达,而 GhARF7-1 对GhLBDs、GhMYBL1的调控分析还在进行中。并且结果还表明GhERF108无法独立激活GhLBD30和GhMYBL1的表达,这说明 GhLBD30和 GhMYBL1 不是 GhERF108 的直接下游靶基因。为了进一步分析GhERF108与GhARF7-2的互作是否影响GhARF7-2 对其下游 GhLBD30 和 GhMYBL1表达,将 GhERF108、GhARF7-2 以及GhLBD30/GhMYBL1的农杆菌菌液按照1:1:1的比例混合,注射幼嫩的烟草下表皮,进行转录激活实验。结果表明GhERF108能够增强GhARF7-2对GhLBD30和GhMYBL1的激活作用。上述结果表明,GhERF108可能通过与GhARF7-2相互作用而调控GhLBD30和GhMYBL1的表达,从而调控棉纤维细胞次生壁发育。