论文部分内容阅读
二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid）–磷脂主要存在于乌贼的肌肉和卵中,是一种新型的天然产物。磷脂是动植物体内细胞膜的骨架成分,其双分子层结构维持着膜内外物质和信息的传递。DHA具有广泛的生理活性,如降血脂、预防动脉硬化、抑制肿瘤生长和免疫调节等作用。目前已证实,磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine PC）在Sn–2上位结合DHA后能够显示更好的生理活性。本文利用从鸢乌贼卵中提取制备的DHA–磷脂（其中PC含量为64.4%,脂肪酸组成中DHA占30%–40%）,探讨了DHA–PC的抗肿瘤活性及其作用机制;DHA–PC的免疫调节作用;DHA–PC对小鼠智力的影响以及对正常小鼠脂质代谢的调节作用。主要研究结果如下:以肝癌细胞HepG–2为研究对象,研究了DHA–PC的体外抗肿瘤作用。采用MTT法证明了DHA–PC能够显著抑制HepG–2细胞的增殖（P<0.05, P<0.01）,具有显著的时效和量效关系;采用AO/EB染色法证明DHA–PC能够诱导细胞出现明显的凋亡形态;采用流式细胞术检测证明DHA–PC可以改变细胞的周期,使细胞停滞在G1/G0期。提示DHA–PC对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用,诱导细胞凋亡和细胞G1/G0期阻滞是其主要机制。采用细胞–基质粘附实验法、划痕实验法、Transwell小室重建基底膜侵袭实验、鸡胚尿囊膜实验以及Western-blotting法分别检测肿瘤细胞粘附、迁移、侵袭、血管新生以及肿瘤细胞VEGF的表达等能力,探讨了DHA–PC的体外抗肿瘤转移作用。结果表明:DHA–PC作用HepG–2细胞48h后,减弱了细胞与基质的粘附作用,其效应呈浓度依赖性（P<0.05, P<0.01）,显著抑制HepG–2细胞的迁移能力（P<0.05）,降低HepG–2细胞的侵袭能力（P<0.05, P<0.01）,显著抑制血管的新生,呈现浓度依赖效应,下调肿瘤细胞血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的表达。提示DHA–PC能够抑制肿瘤细胞的转移,其作用机制可能与降低肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭能力、抑制肿瘤血管新生以及肿瘤细胞VEGF的表达有关。利用S180建立移植性肿瘤小鼠模型,研究了DHA–PC的体内抗肿瘤作用。采用不同剂量（50、200mg/kg.bw）的DHA–PC灌胃荷瘤小鼠14d,结果表明:DHA–PC可明显抑制小鼠肿瘤的生长,其平均抑瘤率为38.06%,能够提高肿瘤小鼠血清和肝脏中抗氧化酶GST、GSH–PX（P<0.05, P<0.01）活力和GSH（P<0.05, P<0.01）的含量。肿瘤组织HE染色发现,DHA–PC组癌细胞出现明显褪变;免疫组化染色表明,DHA–PC组肿瘤血管密度显著低于模型组（P<0.05）。提示DHA–PC能够抑制小鼠体内肿瘤的生长,其作用机制与提高体内的抗氧化水平,降低肿瘤血管密度,抑制肿瘤血管的新生有关。探讨了DHA–PC对荷瘤小鼠的免疫调节作用。结果表明:不同剂量（67、134和268mg/kg.bw）的DHA–PC能够提高小鼠脾指数（P<0.05）;显著提高荷瘤小鼠血清溶血素含量（P<0.01）;提高迟发型变态反应（P<0.05, P<0.01）;促进巨噬细胞的吞噬能力（P<0.01）。提示DHA-PC能全面调节机体的特异性和非特异性免疫功能。利用腹腔注射东莨菪碱的方法建立实验性痴呆小鼠模型,灌胃不同剂量（50、100和200 mg/kg.bw）的DHA–PC,观察了其对小鼠智力发育的影响。结果表明:与模型对照组比较,DHA-PC能够显著降低大脑中MAO（P<0.01）、TChE（P<0.01）活力,提高SOD（P<0.05, P<0.01）活力,增加大脑组织中DHA的含量,降低n-6/n-3 PUFAs的比例。提示DHA–PC能够改善模型小鼠的智力。研究了DHA–PC对正常小鼠脂质代谢的调节作用。利用试剂盒法分别检测了血清和肝脏中TC、TG含量,利用气相分析法检测了肝脏中主要脂肪酸的组成。结果表明:与正常对照组比较,DHA–PC可以显著降低小鼠血清和肝脏中的TC、TG含量（P<0.01）,提高肝脏组织中DHA含量（P<0.01）;与大豆磷脂对照组比较,可以显著降低小鼠血清中TC、TG含量（P<0.01）,肝脏中TC、TG含量（P<0.05, P<0.01）,提高肝脏组织中DHA含量（P<0.01）;与DHA对照组比较,DHA–PC能够提高血清中HDL–C含量（P<0.05）,显著降低肝脏中TG含量（P<0.05）。提示DHA–PC可以有效改善正常小鼠的脂质代谢水平,且作用效果要优于单独的DHA和PC。本论文首次全面系统的研究了鸢乌贼卵中DHA–PC的生物活性,填补了国内空白。为水产品加工废弃物的高值化利用开辟了一个新的渠道,为其应用于保健品、医药等领域的研究奠定了实验基础。